SW620细胞RACK1稳定RNA干扰细胞系的构建与鉴定

目的:为研究RACK1在结肠癌发生发展中的作用,构建结肠癌RACK1基因稳定RNA干扰(RNAi)细胞系.方法:根据人Gnb211 cDNA序列,运用干扰原则选择5个干扰位点并合成相应干扰片段,定向克隆入pLentilox3.7干扰载体鼠U6启动子后并测序验证.用干扰及对照质粒分别转染HEK293T细胞48小时后,RT-PCR鉴定干扰效率,选出干扰效率较高的质粒包装慢病毒感染人结肠癌细胞SW620,流式无菌分选出荧光阳性的细胞扩增培养,RT-PCR及Western blotting鉴定慢病毒干扰效率.使用慢病毒构建的SW620 RACK1稳定RNAi细胞系及对照组进行MTT实验初步研究RACK1对SW620增殖的影响.结果:酶切和测序证实RACK1 shRNA质粒构建正确,产生能同时表达绿色荧光蛋白(EGFP)和RACK1 shRNA的慢病毒载体质粒.慢病毒转导SW620并流式无菌分选扩增培养后,与空载体组相比,2个RNAi组均不同程度抑制RACK1表达,RACK1 shRNA5抑制作用最明显,RACK1干扰组细胞增殖得到了抑制.结论:SW620细胞RACK1稳定RNAi细胞系构建成功,为深入研究RACK1在结直肠癌发生发展中的作用奠定了基础.