肺炎克雷伯菌烷基过氧化氢还原酶C的表达纯化及其活性测定

目的 表达、纯化肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)烷基过氧化氢还原酶C(Alkyl hydroperoxide reductase C,Ahpc)并测定其活性. 方法 利用Clustal Omega分析不同细菌Ahpc蛋白的同源性;利用生物信息学方法分析肺炎克雷伯菌Ahpc蛋白的生物学特性.根据Ahpc基因,设计PCR引物,以肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板,PCR扩增Ahpc基因,双酶切后将其连接到pET28a,获得重组质粒pET28a-Ahpc.将重组质粒转化大肠埃希菌,使用IPTG诱导重组Ahpc蛋白的表达,使用亲和层析纯化目蛋白,采用氧化铁二甲酚橙法测定Ahpc蛋白降解叔丁基过氧化氢活性. 结果 肺炎克雷伯菌Ahpc蛋白含有两个半胱氨酸的经典过氧氧化还原蛋白,定位在细菌细胞质,无跨膜结构域.其α螺旋、β片层以及无规卷曲的含量分别为27.8％,19.7％和52.4％.三级结构是由10个同源的Ahpc蛋白组成同源多聚体.Ahpc蛋白具有多个B细胞表位.PCR扩增得到564 bp的Ahpc基因,构建的pET28a-Ahpc重组质粒转化大肠埃希菌BL21 (DE3)后能表达分子质量单位约为24.7 ku的重组Ahpc蛋白.亲和层析法获得纯度较高的重组Ahpc蛋白,纯化的重组蛋白能降解丁基过氧化氢. 结论 成功表达了肺炎克雷伯菌Ahpc蛋白,该蛋白纯化后仍具有降解能够降解丁基过氧化氢的活性,为肺炎克雷伯菌的抗氧化机制研究奠定了基础.