牛源无乳链球菌菌毛岛屿AP2蛋白抗原优势区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立

目的 构建牛源无乳链球菌AP2蛋白原核表达质粒,表达AP2蛋白,并以此为包被抗原建立检测无乳链球菌抗体的ELISA方法. 方法 取pMD18-T-AP2和pET-30a(+)分别进双酶切,酶切片段连接后转染BL21 (DE3)细胞,进行AP2的诱导表达及鉴定.以重组AP2为抗原建立检测无乳链球菌抗体的ELISA方法,并用无乳链球菌、化脓性链球菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌感染兔血清进行检测. 结果 双酶切及PCR鉴定重组质粒构建正确.Western blot分析表明重组AP2蛋白具有反应原性,建立的间接ELISA抗原最佳包被浓度为25 μg/ml,血清最佳稀释度为1∶160,酶标二抗最适稀释度为1∶70.抗体滴度检测显示重组AP2具有良好的免疫原性,3次免疫(56 d)的兔血清抗体滴度达1∶10 000.用该方法检测化脓性链球菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌感染兔血清,均未出现交叉阳性反应. 结论 成功表达了重组无乳链球菌菌毛岛屿AP2蛋白,建立的间接ELISA方法稳定性高,特异性良好,可用于无乳链球菌感染检测.