弓形虫Ⅰ、Ⅱ型虫株ROP16基因重组表达载体的构建及其对A549细胞STAT3/6磷酸化水平的影响

目的 探索弓形虫Ⅰ、Ⅱ型虫株ROP16在A549细胞中的功能. 方法 提取弓形虫Ⅰ(RH)、Ⅱ(ME49)型虫株总RNA,PCR扩增ROP16基因全长序列后克隆至真核表达载体pEGFP-N1,转染A549细胞,采用Western blot方法检测细胞中STAT3/6磷酸水平,采用实时荧光定量PCR检测IL-12、iNOS、ARG1mRNA表达水平. 结果 PCR扩增Ⅰ、Ⅱ型虫株ROP16基因全长为2148bp.双酶切和测序验证重组载体构建正确,pEGFP-N1-RH ROP16和pEGFP- N1-ME49ROP16过表达载体转染A549细胞后ROP16mRNA表达水平较未转染组上调(P＜0.05,F=824.184, 270.904),pEGFP-N1-ME49ROP16转染A549细胞p-STAT3/6表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05,F =1.051,1.203),IL-12 、iNOS mRNA 与对照组表比呈高表达(P＜0.01,F=157.705,173.623).pEGFP-N1-RH ROP16转染组相比A549细胞对照组p-STAT3/6表达水平上调(P＜0.05,F=121.227,68.324),IL-12mRNA表达下调(P＜0.01,F=186.397),ARG1mRNA表达上调(P＜0.01,F=126.236). 结论 弓形虫Ⅰ型RH 株ROP16蛋白具有激活p-STAT3/6作用,且能使ARG1mRNA 的表达上调,IL-12mRNA的表达下调,而弓形虫Ⅱ型ME49虫株 ROP16蛋白则无激活p-STAT3/6作用,但能使IL-12mRNA和iNOS mRNA的表达上调.