蜡样芽孢杆菌非溶血性肠毒素基因的原核表达及多克隆抗体制备

目的 分别对非溶血性肠毒素基因(Nhe)的3个亚基进行原核表达,并对蜡样芽孢杆菌分泌的非溶血性肠毒素蛋白进行免疫学鉴定. 方法 根据NCBI数据库非溶血性肠毒素NheA、NheB、NheC基因序列设计引物,以蜡样芽孢杆菌的基因组为模板,PCR扩增NheA、NheB、NheC基因.分别将3个基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)后转化到大肠埃希菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达目的蛋白,进行SDS-PAGE分析以及Western blot分析,并免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体. 结果 经PCR和酶切鉴定,成功构建重组表达载体.重组表达载体分别转化至BL21 (DE3),经IPTG诱导表达相应的目的蛋白,分子质量单位分别为NheA 40 ku,NheB 44 ku,NheC 40 ku.经电离飞行时间质谱鉴定,重组蛋白NheA、NheB和NheC表达正确.3种目的蛋白经SDS-PAGE电泳后分别割胶回收,免疫新西兰大白兔,获得重组多克隆抗体. 结论 成功构建了NheA、NheB、NheC基因重组表达载体,表达的重组蛋白免疫新西兰兔获得相应的克隆抗体,为进一步研究非溶血型肠毒素的结构和功能奠定了基础.