蓝氏贾第鞭毛虫PPDK多肽抗体制备与定位研究

目的 制备蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫)磷酸烯醇式丙酮酸双激酶(PPDK)特异性多肽抗体并进行PPDK定位.方法 采用DNAstar软件和BIOSUN生物医学软件,结合抗原表位分析的基本原理,对贾第虫PPDK的氨基酸序列进行抗原分析,最终确定贾第虫PPDK的优势抗原表位肽.将上述抗原表位肽与KLH进行偶联,获得3个偶联蛋白,经脱盐柱吸附、洗脱纯化后,对抗原表位肽-KLH偶联蛋白进行定量测定.将得到的3条多肽-KLH偶联物混合,用PBS稀释为1 mg/ml,分别与第1、15、29和43 d免疫4只新西兰白兔[于颈背部皮下多点(至少8点)注射多肽抗原2mg],获得抗PPDK抗血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot试验检测抗体的滴度和特异性.以R3为一抗,以DyLight 649抗兔IgG为二抗,采用免疫荧光法进行PPDK的细胞定位.结果 根据PPDK抗原分析结果,最终确定PPDK的优势抗原表位3个,即p1:TPENQPANSELC(氨基酸位点12-23),p2:KTRYGRKTDPELC(氨基酸位点167-178)和p3:DLQKKLAEDMNKKHC(氨基酸位点641-654).与KLH偶联获得3个多肽偶联蛋白,即P1、P2和P3.3个偶联蛋白联合免疫新西兰白兔获得4份抗PPDK抗血清,纯化后的抗体分别命名为R1、R2、R3和R4.Western blot检测显示,R3和R4可与PPDK特异性结合,无交叉反应.以R3为一抗进行免疫荧光试验,结果显示pp-DK主要定位于贾第虫细胞的胞浆内.结论 本研究获得2个可与贾第虫PPDK特异性结合的抗体,并初步判断pp-DK主要分布于贾第虫细胞胞浆,为PPDK功能研究奠定了基础.