人CaMKKβ蛋白的原核表达、纯化及活性测定
Chinese Medicinal Biotechnology(2014)
Abstract
目的对原核体系表达的 CaMKKβ蛋白体外活性进行探索,为针对 CaMKKβ、AMPK 药物研发提供科研基础。
方法克隆人 CaMKKβ基因,建立原核表达载体pET28a-CaMKKβ,将其转化入 E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞内,在16℃、0.02 mmol/L IPTG 条件下诱导重组表达CaMKKβ蛋白,Ni-NTA 纯化6His-CaMKKβ蛋白,并利用 Glo?Max Assay 方法检测其活性。
结果通过基因测序表明 pET28a-CaMKKβ质粒构建成功;重组人 CaMKKβ蛋白可溶性表达量较高,Ni-NTA 纯化6His-CaMKKβ蛋白纯度可达80%以上,活性检测结果表明,大肠杆菌体系内表达的人 CaMKKβ蛋白在 CaM/Ca2+存在与否情况下,酶活基本一致。
结论成功构建原核表达载体 pET28a-CaMKKβ,实现重组人 CaMKKβ在原核体系内可溶性表达,活性测定表明原核体系内表达的 CaMKKβ自主酶活性较强,受 CaM/Ca2+影响较小。
More方法克隆人 CaMKKβ基因,建立原核表达载体pET28a-CaMKKβ,将其转化入 E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞内,在16℃、0.02 mmol/L IPTG 条件下诱导重组表达CaMKKβ蛋白,Ni-NTA 纯化6His-CaMKKβ蛋白,并利用 Glo?Max Assay 方法检测其活性。
结果通过基因测序表明 pET28a-CaMKKβ质粒构建成功;重组人 CaMKKβ蛋白可溶性表达量较高,Ni-NTA 纯化6His-CaMKKβ蛋白纯度可达80%以上,活性检测结果表明,大肠杆菌体系内表达的人 CaMKKβ蛋白在 CaM/Ca2+存在与否情况下,酶活基本一致。
结论成功构建原核表达载体 pET28a-CaMKKβ,实现重组人 CaMKKβ在原核体系内可溶性表达,活性测定表明原核体系内表达的 CaMKKβ自主酶活性较强,受 CaM/Ca2+影响较小。
Translated text
Key words
Ca(2+)-calmodulin dependent protein kinase,AMP-activated protein kinase,Chromatogrophy affinity,CaM/Ca2+
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