TIPE2基因过表达慢病毒载体的构建及转染人脐静脉血管内皮细胞

目的 构建肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2(TIPE2)基因过表达慢病毒载体,包装慢病毒并体外感染人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC).方法 设计TIPE2基因扩增引物,PCR扩增获得人源TIPE2目的基因片段并进行纯化,构建重组质粒GV287-TIPE2经琼脂糖凝胶电泳鉴定并进行测序鉴定.重组质粒GV287-TIPE2转染293T细胞构建GV287-TIPE2慢病毒载体,收获并浓缩病毒颗粒,实时定量PCR法检测病毒滴度.GV287-TIPE2过表达慢病毒体外转染HUVEC,荧光显微镜下鉴定转染效率,免疫印迹法检测转染细胞的TIPE2蛋白表达.结果 PCR及测序鉴定证实重组质粒GV287-TIPE2中TIPE2基因目的片断插入位置和序列正确.包装的GV287-TIPE2慢病毒载体其病毒滴度为2.0×108 TU/ml.GV287-TIPE2过表达慢病毒转染293T细胞后在荧光显微镜下可见绿色强荧光;收获病毒转染HUVEC后,在荧光显微镜下可见绿色荧光,且荧光强度不随培养时间延长而衰退.免疫印迹显示,GV287-TIPE2过表达慢病毒转染HUVEC后其TIPE2蛋白表达明显升高(P<0.001).结论 成功构建GV287-TIPE2慢病毒载体,包装得到高浓度病毒液,转染HUVEC能稳定过表达TIPE2蛋白,为后续TIPE2的功能和机理研究奠定了实验基础.