骨形态发生蛋白2基因转染人羊水干细胞复合β-磷酸三钙支架促进骨再生

目的 研究重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白2(BMP-2)基因转染人羊水干细胞(hAFSC)的体外成骨分化,评价基因修饰的hAFSC负载于β-磷酸三钙(β-TCP)多孔支架后体内成骨能力.方法 收集人工破膜后的中段羊水原代培养hAFSC,免疫磁珠分选CD117/c-kit阳性的hAFSC,分别转染腺病毒介导的BMP-2或增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,转染组转染BMP-2和EGFP基因、对照组转染无BMP-2编码序列的EGFP基因,空白组不做病毒转染.48 h后荧光显微镜下观察细胞荧光表达及生长状况,应用流式细胞仪检测转染率.转染第7、14、21、28天采用ELISA检测各组hAFSC培养液中的BMP-2分泌量以确认转染后目的蛋白表达效果.各组hAFSC成骨诱导14d后进行碱性磷酸酶(ALP)染色,28 d后进行茜素红染色评价成骨能力;成骨诱导3、7、14d后定量检测各组细胞ALP活性.20只8周龄裸小鼠随机分为Adv-hBMP-2-hAFSC-β-TCP组、Adv-EGFP-hAFSC-β-TCP组、hAFSC-β-TCP组和β-TCP组,每组5只,将细胞载体复合物植入各组裸小鼠股骨,8周后观察异位成骨组织学情况.结果 hAFSC生长良好,Adv-hBMP-2或Adv-EGFP基因转染48 h后荧光显微镜下见细胞贴壁良好,发出强绿色荧光,无死细胞产生,转染阳性率达(89.00±4.25)％.转染Adv-hBMP-2组hAFSC培养液上清中BMP-2第7、14、21、28天分别为(3.405±0.229)μg/L、(4.575±0.179)μg/L、(3.910±0.175)μg/L、(2.694±0.205)μg/L,第14天蛋白BMP-2分泌已达到高峰且第28天仍有蛋白表达,各时间点均明显高于对照组与空白组(均P＜ 0.05).hAFSC成骨诱导14d后细胞相连成片,与对照组及空白组比较,ALP染色转染组染色阳性面积更大、阳性细胞数量更多.成骨诱导28 d后茜素红染色见转染组细胞多中心聚集,伴大量红色钙结节形成,结节数量与大小明显优于对照组与空白组.成骨诱导3、7、14 d后各组ALP表达均升高,其中转染组ALP分泌逐渐增多,各时间点均高于空白组及对照组(均P＜0.05);对照组及空白组ALP分泌在成骨诱导3、7、14 d后均升高,各时间点ALP定量差异无统计学意义.体内植入8周后,Adv-hBMP-2-hAFSC-β-TCP组较其余3组材料降解更快,骨形成更多,未见纤维组织产生;Adv-EGFP-hAFSC-β-TCP和hAFSC-β-TCP组出现少量新生骨,材料降解较慢;β-TCP组单独植入后无明显降解,少量新生骨形成.结论 BMP-2基因转染的hAFSC有利于加强骨再生.