1,25-维生素-D3体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的最适浓度

目的 探讨1,25-维生素D3(1,25-vitamin-D3)体外诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化的最适浓度.方法 采用全骨髓贴壁法结合密度梯度离心法分离培养SD大鼠BMSCs,应用3、6、12、24 nmol/L1,25-vitamin-D3对第2代BMSCs进行定向诱导,倒置相差显微镜下动态观察细胞生长状况.运用流式细胞仪对BMSCs进行鉴定.应用免疫细胞化学、免疫荧光及Western blotting法检测诱导后4周的BMSCs原肌球蛋白(TPM)、间隙连接蛋白43(Cx43)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达情况.运用透射电子显微镜观察分化细胞与心肌细胞类似的超微结构.在诱导后1、2和4周这3个时间点,以Real-time PCR法检测细胞心肌早期转录因子GATA结合蛋白4 (GATA4)、Nkx2.5的表达.结果 1.倒置相差显微镜下观察,原代细胞培养72 h后,大部分细胞呈短梭形;培养1周后,细胞呈现出多样化的形态;诱导4周的BMSCs,相邻细胞间联系紧密,排列具有明显的方向性.不同浓度1,25-vitamin-D3诱导后的BMSCs,其数量及形态存在差异.2.流式细胞术的鉴定结果显示,CD29、CD45、CD90的阳性表达率分别为97.4％、3.3％和91.4％.3.免疫细胞化学、免疫荧光及Western blotting法检测不同浓度1,25-vitamin-D3诱导4周后的BMSCs均可见TPM、Cx43及cTnT的阳性表达,其中6 nmol/L组的表达均最高,而未诱导组细胞呈弱阳性或阴性表达,差异具有统计学意义(P＜0.05).4.透射电子显微镜观察,细胞诱导培养至4周,胞质内可见较多平行排列的肌丝及线粒体、核糖体、粗面内质网等细胞器.5.Real-time PCR检测结果显示,GATA4及Nkx2.5基因于诱导后1周表达增强,2周表达减弱,4周表达增强;4个诱导组相比较,6 nmol/L组明显优于其他3组(P＜0.05).结论 1,25-vitamin-D3可以诱导BMSCs获得心肌分化表型,其诱导分化最适浓度为6 nmol/L.