利用CRISPR/Cas9系统构建4T1细胞CXCR4基因敲除稳定细胞株
Acta Anatomica Sinica（2018）
Abstract
目的 利用CRISPR/Cas9系统敲除4T1细胞中的CXCR4基因,构建稳定敲除CXCR4基因的4T1细胞株.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,在美国国立生物技术信息中心(NCBI) 上找到CXCR4基因序列的外显子区域,设计两条sgRNA,用LentiCRISPRv2作为载体构建LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒并转化至感受态的Stbl3菌体中,挑取单克隆测序验证并扩大培养提质粒后转染至293T细胞中包装成慢病毒.收集病毒并感染4T1细胞,通过嘌呤霉素筛选并用有限稀释法分离培养出单克隆细胞.提取筛选出的单克隆细胞基因组DNA并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增并测序;用Real-time PCR检测细胞株CXCR4基因mRNA表达情况;用免疫印迹法检测CXCR4蛋白质的表达情况.结果 LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒构建成功;经过基因组DNA片段PCR扩增测序得1株缺失27 bp的稳定敲除CXCR4基因的细胞株;细胞株CXCR4mRNA的表达量低且几乎无CXCR4蛋白质的表达.结论 通过CRISPR/Cas9系统获得靶向敲除CXCR4基因的重组质粒,并筛选出稳定敲除CXCR4基因的细胞株.
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Key words
CRISPR/Cas9,Gene knockout,CXCR4,4T1 cell,Real-time PCR,Western blotting
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