通督活血汤含药血清可抑制椎间盘纤维环细胞的焦亡

背景:腰椎间盘退变是腰椎间盘突出症的主要病理改变,与椎间盘纤维环细胞的程序性死亡密切相关.既往临床研究表明,通督活血汤治疗腰椎间盘突出症疗效显著,其是否通过抑制椎间盘纤维环细胞焦亡起作用值得深入研究.目的:通过观察通督活血汤含药血清对脂多糖/ATP诱导的椎间盘纤维环细胞焦亡的影响,探讨通督活血汤治疗腰椎间盘突出症的可能作用机制.方法:将36只10周龄SD大鼠以通督活血汤灌胃,连续灌胃7d后腹主动脉取血,制备含药血清.提取4周龄SD大鼠的腰椎间盘,采用机械-酶消化法提取椎间盘纤维环细胞,培养至第2代后采用甲苯胺蓝染色法和Ⅱ型胶原免疫组化染色法进行鉴定.之后将第2代细胞随机分为空白组、模型组、含药血清低、中、高剂量组,除空白组外,其余4组予脂多糖/ATP制造细胞焦亡模型,成模后低、中、高剂量含药血清组分别予5％,10％,20％通督活血汤含药血清干预,空白组不采取任何干预措施.采用MTT法摸索含药血清干预椎间盘纤维环细胞焦亡的最佳干预浓度和最佳干预时间;采用流式细胞术Annexin V FIFT/PI双染测定细胞焦亡率;采用ELISA法检测各组细胞上清液的白细胞介素1β、白细胞介素18的表达量;采用qRT-PCR检测各组半胱氨酸蛋白酶1、Gasdermin D(GSDMD)、NOD样受体蛋白3基因的表达量;采用WesternBlot法检测各组半胱氨酸蛋白酶1、GSDMD、NOD样受体蛋白3蛋白的表达量.结果 与结论:①MTT结果示:通督活血汤含药血清干预椎间盘纤维环细胞焦亡的最佳干预浓度为10％,最佳干预时间为24 h;②流式细胞术结果示:与空白组相比,其他4组细胞焦亡比率明显增加;与模型组相比,含药血清各剂量组细胞焦亡比率明显下降;与低、高剂量组相比,中剂量组细胞焦亡比率明显下降;③ELISA、qRT-PCR、Western Blot结果示:与空白组相比,其他4组白细胞介素1β、白细胞介素18的表达量、半胱氨酸蛋白酶1、GSDMD、NOD样受体蛋白3的基因及蛋白表达量均显著升高;与模型组相比,含药血清各剂量组均显著降低;各剂量组组间比较,中剂量组表达量显著低于低、高剂量组;以上差异均有显著性意义(P＜0.05);④提示通督活血汤含药血清可有效缓解脂多糖/ATP诱导的椎间盘纤维环细胞发生焦亡,减轻炎症反应;中剂量组在延缓细胞焦亡、减轻炎症反应方面疗效最佳.