荧光活性染料Dil标记人脂肪干细胞

目的:观察荧光活性染料Dil标记的人脂肪干细胞生长增殖情况,为脂肪干细胞研究寻找理想的细胞标记方法.方法:实验于2006-06/09在广州市创伤外科研究所完成.取人吸脂术中吸出的脂质部分,知情同意并签署知情同意书,用PBS缓冲液反复冲洗,剪刀剪碎.0.1%胶原酶37℃消化40min,使用等量体积含体积分数为0.1胎牛血清+DMEM+双抗完全培养基中和后,1 300 r/min离心5 min,去上清液,沉淀混悬后150 UM尼龙网过滤,按1×104-2×104接种于25 cm2培养瓶中,置入37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养,2～3 d换液.待细胞生长融合达80%即可传代,取第3～4代细胞供实验用.将收集细胞用PBS清洗离心2次,加入无血清DMEM制成细胞悬液,以1×109 L-1密度加入5μL Dil应用液,37 ℃下孵育20 min,1 500 r/min离心5 min,PBS清洗离心2次,加入含体积分数为0.1胎牛血清DMEM培养基,应用荧光显微镜观察24,48,72 h脂肪干细胞显色情况及形态变化.检测脂肪干细胞上清液乳酸脱氢酶含量及细胞XTT比色值,分析脂肪干细胞受损及增殖情况.结果:①Dil标记脂肪干细胞体外观察:台盼蓝染色见脂肪干细胞活力好,仅偶见蓝染细胞,荧光显微镜下观察,见全部细胞标记后均显红色荧光,标记的脂肪干细胞呈梭形,胞浆丰富,保持了良好的正常形态,Dil标记阳性率为100%.Dil标记后早期细胞形态呈荧光环状,48 h后细胞中荧光颗粒增多,荧光增强,细胞核未染荧光.②培养脂肪干细胞上清液中乳酸脱氢酶含量及XTT法检测脂肪干细胞受损及增殖情况:未标记Dil的脂肪干细胞与标记Dil的脂肪干细胞形态、细胞上清液乳酸脱氢酶含量及XTT值差异不明显(P＞0.05).结论:①Dil能有效标记体外脂肪干细胞,并在细胞内稳定表达.②Dil标记的脂肪干细胞形态良好,对活体细胞无毒性.