兔骨髓基质细胞体外培养的操作技术特征

目的:探讨原代细胞取材、分离方法及首次换液时间对体外培养兔骨髓基质细胞生长、增殖的影响.方法:实验于2004-01/06在山东中医药大学细胞学实验室完成.选择普通级4周龄雌性新西兰大白兔1只,抽取其两侧股骨大转子部骨髓液2 mL,加入到盛有等体积Ficoll淋巴细胞分离液的离心管中分离单个核细胞,进行首次提纯获取骨髓基质单细胞,置培养箱中培养传代,逐日在倒置显微镜下观察细胞生长情况.培养5 d后,轻轻振荡培养瓶,吸除培养液,以后每两三天换液1次.继续传代.观察、记录、绘制细胞生长曲线并测定细胞群体贴壁及融合单层时间,观察细胞形态变化和生长增殖情况.在操作方法中注重了以下3点:①原代细胞培养取材于4～8周龄的新西兰大白兔.②分离方法采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞进行初次提纯获取骨髓基质细胞,消化时间不宜超过5 min.在分离、纯化操作减少离心次数和时间,减少吹打和抽吸的次数,以避免对细胞的机械性损伤.③首次换液时间:选择在原代细胞接种后5 d行初次换液比较合适.结果:①兔骨髓基质细胞体外培养生长增殖及形态变化:原代培养细胞接种后见大量悬浮呈圆形的细胞,轮廓清晰.24～36 h后开始贴壁,呈不规则形态或呈类圆形或椭圆形.48～72 h时呈集落生长,显示为短梭形或星形.4 d时每个细胞集落中心部位细胞轮廓不清,体积较小,周边细胞呈细梭形,向周围呈辐射状排列.6 d时贴壁细胞呈长梭形外观,部分区域融合成片.13～16 d细胞融合单层,呈典型细长梭形外观,成集束状排列.传代细胞形态一周左右融合成单层.②第1代细胞生长曲线:从传代后第1天细胞数量开始增加,第4天增加幅度最大,至第6天细胞数量最大.以后数量略有下降.说明其潜伏期＜24 h,传代培养对数增殖期为2～5 d,对数增殖期结束后,第6天细胞生长缓慢,进入平台期.由此可以得出细胞群体倍增时间约为24h.③第1代细胞贴壁率:传代细胞接种2 h已有部分细胞贴壁,12 h细胞基本贴壁完全,14 h已有部分细胞开始增殖.传代细胞接种存活率为98%.④兔骨髓基质细胞镜下形态观察:苏木精-伊红染色可见骨髓基质细胞呈梭形、多角形等,有的有多个树状突起.胞浆呈细网状,淡红色略带蓝色,并见较多胞浆颗粒.细胞核清晰、深蓝色,位于中央,中间可见深染的数个点状染色质,可见分裂相.结论:取材于4～8周龄的新西兰大白兔的骨髓基质细胞采用密度梯度离心法培养传代,以原代细胞接种后5 d行初次换液,在此体外培养条件模式下,兔骨髓基质细胞早期生长性状稳定,增殖速度快,适应性强,呈典型的成纤维细胞样外观,可连续观察10代以上仍具有以上特征,未出现明显衰老现象,适合用作骨组织工程学的种子细胞.