靶向大鼠β-catenin基因的shRNA真核表达质粒的构建与筛选

目的 构建靶向β-连环蛋白(β-catenin)基因的shRNA的真核表达质粒,并筛选出沉默β-catenin基因效果最明显的shRNA表达质粒.方法 设计3对针对β-catenin 基因不同位点的shRNA片段,构建携带此shRNA片段的真核表达质粒(shRNA1～3)并行测序分析,电穿孔转染神经干细胞(neural stem cells NSCs),测定转染率,并分别采用RT-PCR及Western 印迹检测β-catenin mRNA和蛋白表达情况,免疫组化方法检测shRNA对神经干细胞分化的影响.结果 构建靶向β-catenin基因的shRNA真核表达重组质粒shRNA1,2,3.经筛选,NSCs转染shRNA3后,β-catenin RNA水平和蛋白水平均明显低于阴性对照组和空白对照组(0.08±0.00 vs 0.75±0.01,0.74±0.02;0.12±0.10,vs 0.56±0.02,0.65±0.01,P均＜0.01;与空白组和阴性对照组相比,shRNA3组NSCs分化为GFAP阳性细胞的百分率明显增加,分化为NSE阳性细胞的百分率明显减少(P＜0.05).结论 β-catenin RNA3对神经干细胞的β-catenin表达具有明显抑制作用,可影响细胞的分化.为研究wnt/β-catenin信号途径在NSCs生长分化中的作用奠定基础.