gremlin1基因的诱变及其真核表达载体的构建

目的:分别构建全长、无信号肽、无核定位系统和既无信号肽也无核定位系统的大鼠gremlin1基因的真核表达载体.方法:采用PCR技术获得全长大鼠gremlin1基因(gremlin1)和无信号肽的gremlin1基因(gremlin1-DS),以全长gremlin1为模板运用重叠延伸PCR获得无核定位系统的gremlin1基因(gremlin1-DN),继而在gremlin1-DN的基础上去掉信号肽获得既无信号肽也无核定位系统的gremlin1基因(gremlin1-DS-DN).分别将4组重组质粒转染到非洲绿猴肾细胞株cos7中,免疫荧光和蛋白免疫印迹检测gremlin1基因的表达.结果:构建的真核表达载体pEF1/Myc-HisC-gremlin1、pEF1/Myc-His C-gremlin1-DS、pEF1/Myc-His C-gremlin1-DN和pEF1/Myc-His C-gremlin1-DS-DN经PCR与酶切鉴定显示目的片段大小与预期结果一致；经DNA测序显示pEF1/Myc-His C-gremlin1中的gremlin1片段与Gene Bank中的gremlin1序列(NM-019282)完全吻合；pEF1/Myc-His C-gremlin1-DS中的gremlin1基因缺失信号肽序列；pEF1/Myc-His C-gremlin1-DN中的gremlin1片段实现了4个定点突变:433-435位的AAG(赖氨酸)、487-489位的CCA(脯氨酸)、490-492位的CCC(脯氨酸)、496-498位的AAG(赖氨酸)均突变为TTC(苯丙氨酸)；pEF1/Myc-His Cgremlin1-DS-DN中的gremlin1基因既缺失信号肽序列又实现了4个定点突变.将它们分别转染到cos7细胞后,免疫荧光和蛋白免疫印迹检测显示,4者均能在细胞内成功表达.结论:成功构建了pEF1/Myc-HisC-gremlin1、pEF1/Myc-HisC-gremlin1-DS、pEF1/Myc-His C-gremlin1-DN、pEF1/Myc-His C-gremlin1-DS-DN的真核表达载体.