乙肝病毒常见耐药位点突变高通量检测方法的建立与应用

目的 建立准确、快速、灵敏、高通量的检测常见乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)耐药位点突变的临床检测方法.方法 设计针对聚合酶YMDD区及其附近常见耐药突变区域和基本核心启动子区(basic core promoter, BCP)1762、1764双突变区域的扩增引物,经PCR扩增及磁珠分离,制备焦磷酸测序单链模板,并在PyroMark ID遗传分析系统上进行焦磷酸测序,批量检定300例临床血清标本,与目前常用的YMDD试剂盒和Sanger测序法测序结果进行比较.结果将PCR扩增得到HBV P区和BCP区产物经琼脂糖凝胶电泳显示:HBV定量结果阳性(拷贝数≥10<'3>)的标本均能得到清晰地PCR产物条带.焦磷酸测序进行突变频率检测具有极高的准确性,且能够进行低频率(<5%)的突变检测.焦磷酸测序法和Sanger测序法检测突变位点得到的结果一致,匹配率达100%,而YMDD荧光定量检测法检测突变位点与上述两法匹配率仅为75%.结果 本文成功建立了基于焦磷酸测序技术的HBV常见耐药突变检测平台,实现了临床血清标本的高通量检测.该方法具有较好的灵敏度、特异性和准确性,且能进行低频率(<5%)突变检测.该测序系统比Sanger测序具有更高的通量、更准确的结果及快速简便的操作,是一种适用临床常见HBV耐药突变位点分析的检测技术,易于在临床推广应用.