定量PCR法监测白血病细胞微小残留病

目的：建立实时定量监测白血病细胞WT1基因表达的方法。方法：设计并合成WT1基因的全长引物，筛选引物和定量引物，构建HL60细胞的cDNA文库，从中调取并纯化WT1全长基因，通过Hind III与EcoR I的双酶切，连接构建到克隆载体pUC19中，通过菌落PCR，测序鉴定出阳性克隆pUC19- WT1。按有限稀释法制备标准品质粒pUC19- WT1，绘制WT1基因的扩增曲线，熔解曲线和标准曲线，建立全反式维甲酸诱导HL60细胞分化的模型，实时定量PCR法监测在ATRA处理HL60细胞后WT1基因的表达水平。结果：从HL60细胞的cDNA文库中扩增得到全长WT1基因，并构建到克隆载体pUC19中，菌落PCR筛选出阳性克隆pUC19- WT1，测序与预期相符合。WT1基因扩增的熔解曲线显示，Tm值为84，WT1的扩增，标准曲线显示，扩增效率为96%，R值为0.98。通过实时定量PCR监测ATRA诱导HL60细胞2天后，WT1基因表达水平显著下调。结论：成功建立了实时定量PCR监测白血病细胞中WT1基因表达的方法,为白血病以及微小残留病的临床监测奠定基础。