分段扩增法克隆大鼠5-脂肪氧合酶cDNA并鉴定其序列

目的 5-脂肪氧合酶(5-LO)是炎性介质白三烯合成过程中的限速酶,本研究克隆大鼠5-LO cDNA编码区,旨在为利用大鼠5-LO分析白三烯在血管壁炎症中的作用做准备.方法 从SD大鼠胚肝中提取mRNA并逆转录成cDNA,找出5-LO cDNA中独特的内切酶位点,再设计2对引物,扩出都含此酶切位点的5-LO cDNA片段.用高保真酶分段扩增出2个5-LO cDNA片段,再正确拼接,克隆成功后酶切鉴定并测序.将获取的cDNA序列与NCBI和Ensembl数据库比较序列的差异.结果 用Oligo (dT)和随机引物从SD大鼠胚肝总mRNA中逆转录cDNA.以5-LO cDNA独特的Pml Ⅰ内切酶位点为分界点,扩增出5'端1339 bp和3'端790 bp的5-LO cDNA片段,将2个片段正确地拼接在pBluescriptⅡSK(+)中.经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切和测序显示,重组质粒中包含有5-LO cDNA编码区全长2025 bp,它与Ensembl数据库中的序列完全一致,但与NCBI数据库中的序列有较大的差异.结论 用分段扩增法从SD大鼠胚肝中成功克隆出全长5-LO cDNA编码区,并证实了其序列的正确性.