探讨白藜三醇抑制快速电刺激乳鼠心肌细胞氧化应激损伤及其机制

目的：探讨白藜三醇（Resveratrol，RSV）对快速刺激乳鼠心肌细胞氧化应激损伤的保护机制。方法：本实验采用胰酶和胶原酶双酶法及差速贴壁法分离新生大鼠心肌细胞和成纤维细胞。心肌细胞随机分为5组：空白对照组、快速电刺激组（RES组）、快速电刺激+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶抑制剂夹竹桃麻素组（RES+APO组）、快速电刺激+白藜三醇组（RES+RSV组）、快速电刺激+钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂组（RES+AIP组）。为了证实白藜三醇是否还通过蛋氨酸亚砜还原酶—氧化型钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（MsrA-OX-CaMKⅡ）途径对心肌细胞产生保护作用。除了上述5组，另设了MsrA竞争性阻断剂0.5%二甲基亚砜（DMSO）对照组（DMSO对照组）和RSV+DMSO组，RES+RSV+DMSO组。细胞计数Kit-8（CCK-8）法检测心肌细胞活性以确定白藜三醇的最佳浓度，采用酶联免疫吸附检测法（ELISA）检测细胞培养液中AngⅡ水平以选择最佳心肌细胞电刺激时间。流式细胞仪检测心肌细胞内活性氧水平；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测心肌细胞MsrA、NADPH氧化酶4（Nox4）、NADPH氧化酶2（Nox2）、NADPH氧化酶p22phox亚基（P22phox）、OX-CaMKⅡ、凋亡相关激酶半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、Caspase-3剪切蛋白表达。结果（：1）与空白对照组比，RES组心肌细胞AngⅡ分泌显著增加，同时Nox4、Nox2及P22phox、OX-CaMKⅡ、Caspase-3剪切蛋白的表达水平显著增加。（2）与RES组比，RES+APO组、RES+RSV组和RES+AIP组的活性氧水平降低， RES+RSV组降低更明显。（3）与RES组比较，RES+APO组、RES+RSV组的Nox4、Nox2及P22phox、OX-CaMKⅡ、Caspase-3剪切蛋白的表达水平降低，RES+AIP组仅Nox2、OX-CaMKⅡ及Caspase-3剪切蛋白表达水平降低。（4）加入MsrA抑制剂二甲基亚枫（DMSO）后，白藜三醇抑制快速电刺激导致的Caspase-3剪切蛋白表达作用减弱。结论：白藜三醇对快速电刺激乳鼠心肌细胞具有保护作用，其机制可能是抑制NADPH氧化酶及增加MsrA表达，从而减少乳鼠心肌细胞氧化应激损伤。