腺病毒adv-hmepe质粒构建与转染表达优化

目的：构建人细胞外基质磷酸糖蛋白（ hmepe）基因的重组腺病毒pYr-ads-4-hMEPE真核表达载体，并优化其转染条件。方法构建腺病毒包装质粒pYr-ads-4-hMEPE，在HEK293细胞中包装形成腺病毒颗粒，转染前列腺上皮细胞株RWPE1，同时转染空质粒作为对照细胞株。设置腺病毒重组质粒梯度检测最佳转染浓度，免疫印迹检测转染细胞株中 MEPE 蛋白表达水平，确定转染效果。共聚焦显微镜检测不同条件下的转化率。结果经酶切与测序验证，pYr-ads-4-hMEPE重组质粒构建成功，免疫印迹分析验证转染rAd-4-hMEPE的RWPE1细胞株中MEPE蛋白表达水平上调，而转染相应空载体的细胞株中 MEPE蛋白的表达水平与野生型细胞株一致，说明腺病毒质粒构建成功可在真核细胞表达，共聚焦检测分析质粒浓度对转染效率可信度较好。结论成功构建hmepe真核表达载体，重组腺病毒转染RWPE1细胞最佳融合比例1.25∶1000，即质粒量为1.25μl加入1 ml培养液中转染效率最佳。