DNMT3a基因shRNA质粒表达载体的构建及其沉默作用

目的 以DNMT3a mRNA保守序列为靶基因设计针对DNMT3a mRNA的siRNA序列和无效干扰对照序列(HK),并利用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pGensil-1中,构建pGenesil-1-DNMT3a-shRNA、pGenesil-1-HK-shRNA重组质粒.方法 应用转化技术将重组质粒转化到大肠杆菌DH5a中,通过卡那霉素抗性筛选出阳性菌落后提取质粒进行酶切和测序鉴定,应用质粒转染技术转染耐顺铂肺腺癌A549细胞(A549-DDP),利用RT-PCR技术检测转染重组质粒24、48、72 h后DNMT3a的沉默效率.结果 测序结果与合成序列一致,重组质粒不能够被Pst Ⅰ切开,转染pGenesil-1-DNMT3a-shRNA能够明显抑制DNMT3a的表达,抑制率分别达到25.5％,56.2％,63.4％,且呈明显时间依赖性,而pGenesil-1-HK-shRNA无明显抑制作用.结论 成功构建了DNMT3a基因shRNA及HK质粒真核表达载体,为进一步实验研究奠定了基础.