荧光定量聚合酶链反应检测肺炎支原体方法的建立

目的 建立检测肺炎支原体的荧光定量 PCR 法,并与市售试剂盒和传统巢式 PCR 法的检测性能进行比较.方法 设计针对肺炎支原体社区获得性肺炎呼吸窘迫综合征毒素基因的特异性引物,构建含相应目的片段的质粒作为标准品,采用 SYBR Green 染料法进行实时定量 PCR,并绘制标准曲线.通过检测其他细菌和 170 例儿童临床咽拭子样本,比较新建荧光定量 PCR 法、市售试剂盒和传统巢式 PCR 法在临床应用中的差异.结果 新建荧光定量 PCR 法和巢式 PCR 法能够检出的肺炎支原体标准株 DNA 最低模板量为 10 拷贝,市售试剂盒检出最低模板量为 102 拷贝.在特异性实验中 3 种方法均可区分肺炎支原体和其他菌种.在检测的 170 例儿童临床咽试子样本中,新建荧光定量 PCR 法、市售试剂盒和传统巢式PCR 法的阳性率分别为 60.00%、50.00% 和 53.53%.新建荧光定量 PCR 法与市售试剂盒的结果具有高度相关性(r = 0.953), 2 种方法的总符合率为 86%,Kappa 值为 0.729.新建荧光定量 PCR 法与传统巢式 PCR 法的结果总符合率为 90%,Kappa 值为 0.797.结论 新建荧光定量 PCR 法与市售试剂盒相比灵敏性更高,特异性相同,成本低;与传统巢式 PCR 法相比操作简单,耗时短且污染少,具有良好的科研和临床应用前景.