抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对兔原代巨噬细胞自体吞噬的影响及机制

目的 探讨抑制PI3 K/Akt/mTOR信号通路对兔原代巨噬细胞自体吞噬中的影响.方法 分离培养纯种新西兰兔腹腔原代巨噬细胞并分为4组,加入磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002(10 μmol/L)组、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂雷帕霉素(10 nmol/L)组、蛋白激酶B(Akt)抑制剂曲西立滨组(20 μmol/L)以及空白对照组.共培养4h、12 h后分别收集细胞,运用透射电镜观察巨噬细胞自噬体的变化,细胞免疫荧光法检测微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)分子的表达,Western blot检测Akt、mTOR、磷酸化Akt (p-Akt)、磷酸化mTOR(p-mTOR)及自噬相关蛋白Beclin-1和自噬蛋白Atg5-Atg12连接体的表达,单丹酰尸胺(MDC)染色法观察自噬溶酶体的变化.结果 与空白对照组相比,透射电镜下LY294002组自噬体、自噬空泡、髓磷脂图像等自噬标记物明显减少,雷帕霉素组、曲西立滨组明显增多;激光共聚焦显微镜下LY294002组LC3Ⅱ表达显著减少,雷帕霉素组、曲西立滨组表达显著增多;Western blot结果显示LY294002组Beclin-1及Atg5-Atg12蛋白表达水平显著下降,p-mTOR、p-Akt蛋白表达显著减少;雷帕霉素组、曲西立滨组Beclin-1及Atg5-Atg12蛋白表达水平明显上调,共培养4h后p-Akt表达增多,雷帕霉素组p-mTOR表达增多,曲西立滨组减少;共培养12 h后雷帕霉素组、曲西立滨组p-mTOR表达显著减少,雷帕霉素组p-Akt表达显著增多,曲西立滨组显著减少;MDC染色显示LY294002组自噬溶酶体明显减少,雷帕霉素组、曲西立滨组明显增多.结论 抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路能促进兔原代巨噬细胞自体吞噬,抑制PI3K能减少兔原代巨噬细胞自体吞噬,可能是不同类型的PI3K分子通过其他通路起作用.