一种改良大鼠骨髓间充质干细胞培养方法

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离、改良培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测.方法 通过改良全骨髓贴壁法对4周龄SD雄性大鼠脱颈处死,无菌条件下分离出骨髓进行原代培养、消化传代培养及纯化.对BMSCs进行形态学观察,收获第四代BMSCs进行流式细胞仪检测其细胞表面标记物CD90、CD29、CD34、CD45的表达率及向成脂方向诱导分化.结果 BMSCs的原代培养形态学观察可见骨髓细胞接种于培养皿后,细胞呈圆型,大小不一,悬浮于培养液中.24 h后部分细胞开始贴壁,呈圆形、梭形或多角形.通过换液去除未贴壁的杂质细胞,可见短梭形、星形细胞分散贴壁生长,四五天可见放射状排列的细胞集落,伸出长短不一、粗细不均的突起,梭形细胞为主,胞浆丰富,胞核大、核仁清晰.7～8d细胞呈集落生长,融合80％～90％,呈漩涡状,同向排列,9～10 d细胞排列紧密,逐渐融合成片.传代培养可见消化传代后,传代细胞24 h完全贴壁生长.细胞形态均一,呈梭形生长,细胞生长旺盛.四至五天可传代1次.可稳定连续传代7代以上,细胞形态及生长速度未见明显变化.BMSCs表面标记物的表达通过流式细胞仪检测结果显示,培养的第4代大鼠BMSCs均一表达CD90,CD29,阳性率分别为96.9％,96.6％;而CD34,CD45,呈阴性,阳性率分别为0.395％,7.56％.BMSCs加入成脂诱导剂后18d,诱导而成的脂肪细胞累积脂质,脂滴变大,合并呈串珠状,经油红0染色呈鲜红色.结论 与传统全骨髓贴壁法相比,改良后的全骨髓贴壁法操作步骤简单,降低离心对细胞的损害,减少了污染机会,节省经费,且分离的BMSCs细胞活性高,可大量分离、纯化、扩增,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能.可为组织器官缺损性疾病、恶性肿瘤等的治疗和组织工程提供充足的种子细胞来源,具有重要的现实意义.