人白细胞介素-10真核表达载体的构建及其在兔滑膜细胞中的表达

目的 构建人白细胞介素-10(hIL-10)高效真核表达载体,观察其在家兔滑膜细胞(RSCs)中表达.方法 提取人外周血单个核细胞(PBMCs)总RNA作为模板,根据基因库(NM 000572)中hIL-10全长开放读框设计特异性引物,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)一步法扩增hIL-10 mRNA全长开放读框,扩增产物定向克隆人真核表达载体pcDNA4/HisMaxA,并对克隆人真核表达载体的扩增产物进行酶切及DNA测序鉴定,构建的真核表达载体pcDNA4/HisMaxA-hIL-10经阳离子脂质体介导转染兔滑膜细胞RSCs.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染后12、24、48、72 h和7、14 d RSCs培养上清中hIL-10水平.结果 RT-PCR产物约0.54 kb,克隆人真核表达载体pcDNA4/HisMaxA的扩增产物经酶切及DNA测序鉴定与读码框架序列无差别.转染后12 h到第7天细胞培养上清检测出hIL-10,且水平显著性高于对照组(F=21.878,P＜0.01).结论 hIL-10真核高效表达载体pcDNA4/HisMaxA-hIL-10构建成功.