人类免疫缺陷病毒-1整合酶区标准突变株真核表达载体的构建及其应用

目的 构建整合酶区标准突变株真核表达载体,并进行初步功能验证,为HIV-1表型耐药研究提供技术方法.方法 采用点突变的方法,以质粒pNL4-3.Luc.R-E为模板,扩增整合酶区片段(含突变位点Y143、Q148),经过BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切,通过T4 DNA连接酶将纯化的PCR产物与经过BglⅡ和Xho Ⅰ双酶切的pcDNA6.2-LTRgagpolS1连接,命名为pcDNA6.2-LTRgagpol,经过GatewayTM技术的BP/LR反应,将LTRgagpol片段重组到pNL4-3-attR,构成整合酶区标准突变质粒.在聚乙烯亚胺(PEI)转染试剂介导下,与水泡性口膜炎病毒的外壳糖蛋白质粒共转染HEK293细胞,得到HIV-1假病毒,应用整合酶抑制剂拉替拉韦与野生株假病毒进行表型耐药比较,将制备的病毒效价按4∶1的比例感染HEK293细胞,同时加入拉替拉韦,终浓度为1μmol/L,感染48 h后测荧光素酶报告基因.样本间抑制率比较采用单因素方差分析.结果 带有整合酶区主要突变位点的HIV-1标准耐药株(pNL4-3-Q148R、pNL4-3-Y143H)构建成功.应用1μmol/L拉替拉韦进行表型耐药检测时,野生型病毒对拉替拉韦最为敏感,报告基因数值平均为1.72×103,Y143H耐药株(1.18×10 4)和Q148R耐药株(2.82×104)对拉替拉韦表现为耐药,对三者相对荧光素酶单位取对数值做统计学分析,野生株与Y143H耐药株相比差异有统计学意义(F=38.800,P=0.025),野生株与Q148R耐药株相比差异有统计学意义(F=174.355,P=0.006).Y143H耐药株与Q148R耐药株相比,Q148R耐药株对拉替拉韦敏感性更低,差异具有统计学意义(F=22.551,P=0.042).结论 成功构建了带有整合酶区主要突变位点的HIV-1标准耐药株载体,并成功表达,为研究临床HIV-1标本表型耐药典定了基础.