疟原虫种属同检多重PCR方法的建立和应用

目的 建立高效的疟原虫种属特异性检测方法. 方法 设计疟原虫种(核糖体18S rRNA,4对)和属(线粒体基因,1对)特异性引物,与通用引物(5′-CGAGTCCTGCGGTCTCAAATT-3′)连接后,形成5对嵌合特异性引物.常规PCR确定各对引物的最佳退火温度和引物浓度,多重PCR优化5对引物混合后的最佳反应条件,建立反应体系(命名为P5-mPCR方法).用P5-mPCR检测不同原虫密度的间日疟原虫(Pv)、三日疟原虫(Pm)、卵形疟原虫(Po)、恶性疟原虫(Pf)感染者血样和模拟混合感染样品,确定P5-mPCR方法的检测灵敏度.用日本血吸虫、刚地弓形虫、杜氏利什曼原虫、猪囊尾蚴、卫氏并殖吸虫、隐孢子虫等其他寄生虫感染者血样或虫体DNA评价P5-mPCR方法的特异性.用212份疟疾送检血样,与巢式PCR方法比较评价其应用价值. 结果 优化后的P5-mPCR反应体系各组分含量(体积比)为:DNA模板10％、引物Mix 5％、ddH2O35％,Taq酶预混液50％.反应体系的最佳循环条件为:95 ℃ 5min;94℃ 15s,58℃20 s,72 ℃ 20 s,循环5次;94℃15 s,62℃20 s,72℃20 s,循环10次;94℃15 s,68℃20 s,72℃20 s,循环25次;72℃3 min;10℃5 min.扩增产物的长度分别为:Pv778 bp,Pm 582 bp,Po 400 bp,Pf 256 bp,疟原虫属334 bp.其检测灵敏度分别为4.49、5.45、6.39、4.07个虫/μl血(种特异性检测平均值为4.85个虫/μl血)和0.10～1.07个虫/μl血(属特异性检测的平均值为0.41个虫/μl血).P5-mPCR检测含有50～200个虫/μl血的模拟混合样品,各特异性扩增条带均清晰可见;检测日本血吸虫、刚地弓形虫、杜氏利什曼原虫、猪囊尾蚴、卫氏并殖吸虫、隐孢子虫等其他寄生虫样品,结果均为阴性.巢式PCR和P5-mPCR检测212份疟疾送检血样,两种方法检测结果的一致性较高(Kappa=0.866,P＜0.01),检出的阳性率分别为75.0％ (159/212)和79.7％ (169/212),差异具有统计学意义(x2=8.100,P＜ 0.01).从分型诊断来看,两者的差异主要来源于可(P＜0.01)和Po (P＜ 0.05)样品,对Pv、Pm和混合感染血样的检测结果,两种方法差异无统计学意义. 结论 建立的P5-mPCR方法具有敏感性高,特异性好,操作简便快速,检测结果易于判断,一次反应即可确定4种人体疟原虫.