组织工程学黄韧带干细胞的筛选与鉴定

目的:通过Fibronectin介导进行差别粘附法筛选出入黄韧带干细胞并进行鉴定,探讨其作为组织工程种子细胞的可行性.方法:从椎间孔镜或椎间盘镜微创手术中获取10例人黄韧带标本,机械-酶消化法联合获取原代细胞,扩增第二代后接种于Fibronectin包被过的培养瓶.流式细胞仪检测细胞表面特异性标志物.免疫组化方法测定干细胞表达相关特异性蛋白.使用干细胞诱导培养基(实验组)向成骨、成脂、成软骨多向诱导分化,使用常规生长培养基培养者作为阴性对照(对照组),分别行茜素红染色、油红O染色、阿利辛兰染色鉴定.PT-PCR检测成骨、成脂肪、成软骨基因表达.取同一患者的髂骨骨髓提取骨髓间充质干细胞,统计学分析黄韧带干细胞与骨髓间充质干细胞的细胞周期、增殖能力和干性基因表达差异.结果:原代细胞形态呈三角形或多角形,经Fibronectin介导粘附培养后形态比较均一,呈长梭形克隆群.流式细胞仪检测筛选后的黄韧带干细胞CD90、CD73阳性率＞96.8％,CD105阳性率＞95.9％,而stro-1为阴性.实验组茜素红染色呈强阳性,油红O染色可见大小不等脂滴呈红色,阿利辛兰染色大量蛋白聚糖聚集呈蓝色,对照组均为阴性.PT-PCR测定实验组成骨基因(OC、ALP、RUNX-2)、成脂肪基因(LPL、APP、PPA R2)、成软骨基因(COLⅡ、AGG、SOX9)显著上调,其中RUNX-2在对照组有低水平表达.免疫组化显示黄韧带干细胞和骨髓间充质干细胞均表达a-SMA、Ⅰ型胶原、纤连蛋白,但均不表达Ⅱ型胶原.两种干细胞均超过80％的细胞比例处于G0/G1期提示都有很强自我更新能力(P＞0.05).CCK-8检测不同时间点两种细胞的增殖能力,在第1～10天时OD值逐渐增加,第10～14天达稳定状态,二者有相似的增殖能力(P＞0.05).两种干细胞均表达干性基因NONAG、OCT-4、SOX2,组间差异无显著性(P＞0.05).结论:通过Fibronectin差别粘附筛选法可有效筛选纯化出黄韧带干细胞,其可向成骨、成脂、成软骨多向分化,为组织工程技术治疗退变椎间盘提供了新的种子细胞.