检测破骨细胞内活性氧水平方法的实验探究与应用

目的：探究可以有效、准确且直观地检测破骨细胞内活性氧（ ROS）的方法，并应用其对破骨细胞分化过程中活性氧的变化进行检测。方法培养RAW264.7细胞系作为破骨前体细胞。控制细胞密度铺板后装载检测活性氧的2，7-双乙酸二氯荧光素（ DCFH-DA）荧光探针，分别检测阴性对照组（只加α-MEM培养基）、阳性对照组（ ROSup）、核因子κB受体活化因子配体（RANKL）组（100ng／mlRANKL）和N-乙酰左旋半胱氨酸（NAC）组（100ng／mlRANKL＋1mMNAC）破骨细胞的活性氧水平。检测方法包括使用荧光显微镜观察不同组的荧光强度并对阳性细胞计数统计和使用流式细胞仪检测不同组的荧光强度并对Mean FL1-A定量分析。结果阴性对照组与阳性对照组比较，定性的荧光照片和阳性细胞计数统计，与定量的流式细胞术统计图和Mean FL1-A统计分析，都显示阳性对照组的细胞内活性氧水平远高于阴性对照组（ P＜0.001和P＜0.001）。同时， RANKL组的活性氧水平高于阴性对照组（ P＜0.05和 P＜0.01），而 NAC组的水平较RANKL 组为低（ P＜0.001和 P＜0.001）。结论定性观察方法与定量检测方法结果均有效并且高度一致。两种方法的综合使用可以直观准确地检测破骨细胞内的活性氧。使用该方法可验证破骨细胞分化过程中活性氧的增加，并且NAC可抑制此变化。