人PKD2基因慢病毒的构建及其对常染色体显性遗传性多囊肾病小鼠肾脏上皮细胞多囊蛋白-2和Wnt/β-catenin信号通路的修复作用

目的 构建携带入PKD2基因的重组慢病毒载体,并探讨该载体对Pkd2缺失小鼠肾脏上皮细胞中多囊蛋白-2(PC2)的表达,以及对下游Wnt/β-catenin信号通路的作用.方法 2016年8月至2017年2月采用Xba Ⅰ和Xho Ⅰ酶将PKD2基因从已有pcDNA3.1-TM-PKD2质粒中切出,并插入慢病毒空载体pLV-sfGFP_ 2A_Puro,测序验证后获得重组慢病毒载体pLV-sfGFP-PKD2.然后,将重组慢病毒载体与包装质粒共脂质体转染293T细胞,包装病毒,获得病毒浓缩液.按照实验组(pLV-sfGFP-PKD2病毒感染)、对照组(pLV-sfGFP病毒感染)和空白组(未感染)进行分组,分别处理携带Pkd2基因的B3、D3细胞(Pkd2+-)和Pkd2缺失的B2、E8细胞(Pkd2-/-),采用蛋白质印迹法、免疫荧光染色法检测PC2表达情况.最后,选取B3和B2细胞,利用增殖细胞核抗原(PCNA)荧光染色检测细胞增殖活性,实时荧光定量PCR检测PKD2下游Wnt/β-catenin信号通路的变化.结果 重组慢病毒载体酶切后凝胶电泳结果显示插入片段与PKD2基因一致,基因测序结果显示PKD2插入方向正确.经pLV-sfGFP-PKD2病毒感染后,实验组B2和E8细胞的PC2表达量分别为0.668±0.013和0.763±0.021,空白组B3和D3细胞的PC2表达量分别为0.687±0.015和0.776±0.008,差异均无统计学意义(P=0.164,P=0.409).实验组B2细胞增殖活性(0.573±0.010)明显低于空白组(0.848±0.031),差异有统计学意义(P＜0.01);与空白组B3细胞(0.585±0.017)比较差异无统计学意义(P =0.369).实时荧光定量PCR检测结果显示,实验组B2细胞中的Wnt7a和β-catenin基因表达量分别为0.037±0.005和0.554±0.008,与空白组B3细胞的0.037±0.004和0.571±0.013比较差异均无统计学意义(P =0.969,P=0.640).结论 本研究成功构建携带人PKD2基因并具有感染能力的重组pLV-sfGFP-PKD2慢病毒,慢病毒可重建PKD2基因缺失的小鼠肾脏上皮细胞PC2的表达,使过度激活的Wnt/β-catenin信号通路恢复正常,进而降低PC2缺失所导致的细胞异常增殖活性.