短发夹RNA沉默TRPV2基因抑制大鼠脊柱侧凸模型椎间盘退变的实验研究

目的 利用短发夹RNA(shRNA)技术构建TRPV2基因的沉默表达慢病毒载体,探究其在大鼠脊柱侧凸模型椎间盘退变中的作用.方法 本研究采用经典的双足大鼠脊柱侧凸模型构建的方法 .根据基因沉默干扰原理,构建shRNA TRPV2干扰载体,根据实验目的,将SD大鼠分成对照组、模型组和shRNA组.对上述动物模型摄X线片,对椎间盘髓核组织进行HE染色,对椎间盘髓核组织进行II型胶原蛋白和Aggrecan蛋白的免疫组织化学染色,利用RT-PCR和Western blot检测髓核组织中炎性因子iNOS、COX-2、MMP-9和凋亡因子Caspase-6、Caspase-3和Caspase-9的mRNA和蛋白表达水平.结果 慢病毒量转染效率较高,为(92.3±2.7)％.对照组SD大鼠无明显侧凸,模型组SD大鼠脊柱向左侧凸,Cobb's角为(31.22±2.18)°;shRNA组SD大鼠脊柱向左侧凸,Cobb's角为(18.07±3.09)°.RT-PCR结果 显示,模型组髓核组织中炎性因子iNOS、COX-2、MMP-9和凋亡相关因子Caspase-3,6,9的mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05);shRNA组各组分的mRNA表达水平均高于对照组(P<0.05);shRNA组髓核组织中iNOS、COX-2、MMP-9、Bad、Bax和凋亡相关因子Caspase-3,6,9的mRNA表达水平均低于模型组(P<0.05).Western blot蛋白检测结果 与RT-PCR结果 相同.HE染色显示,模型组大鼠椎间盘髓核组织分布紊乱无序,还有纤维断裂.shRNA组大鼠髓核组织有瘢痕愈合,也有正常的髓核组织,排列有序.免疫组织化学染色结果 显示,shRNA组髓核组织中II型胶原蛋白和Aggrecan蛋白的蛋白表达水平均高于模型组(P<0.05).结论 shRNA-TRPV2可以抑制脊柱侧凸鼠模型中髓核细胞的凋亡,降低髓核组织中iNOS以及炎性因子COX-2和MMP-9的表达,对髓核组织的退变起到保护作用.