异黏蛋白调控三阴性乳腺癌细胞干性的机制研究

目的 研究异黏蛋白(MTDH)对三阴性乳腺癌干性的调控机制,并探讨miR-30a-5p对MTDH的调控作用.方法 (1)回顾性分析2017年5月至2018年9月湖北医药学院附属太和医院手术治疗的37例三阴性乳腺癌患者的肿瘤组织标本及同期非三阴性乳腺癌手术切除标本37例.采用免疫组织化学方法检测所有标本中MTDH的表达.(2)用定量RT-PCR和Western blot检测MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-4684种细胞系中MTDH的mRNA和蛋白表达.(3)为了探讨MTDH对三阴性乳腺癌细胞干性、细胞增殖及Wnt/β-catenin信号通路的影响,用MTDH的siRNA转染三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468(siMTDH组),无效干扰RNA转染的细胞作为对照组.用Western blot检测MDA-MB-231、MDA-MB-468细胞系中干细胞标志物sox2、Nanog及CD133相对表达量,用细胞克隆实验观察细胞克隆数,用Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、Myc和cyclin D1的表达.(4)荧光素酶报告实验:为评估miR-30a-5p能否靶向调控MTDH,用MTDH的3′-UTR和miRNA-30a-5p合成含有MTDH 3′-UTR野生型和突变型荧光素酶报告质粒,分别转染HepG2细胞,pGL3空载体转染细胞作为空载体组,24 h后观察荧光.三阴性乳腺癌与非三阴性乳腺癌组织中MTDH蛋白表达比较用t检验.4种细胞系中MTDH mRNA及蛋白表达比较用方差分析.对照组与siMTDH组中sox2、Nanog、CD133、β-catenin、Myc、cyclin D1蛋白表达及细胞克隆数比较用t检验.细胞相对荧光比值比较采用方差分析.组间两两比较采用LSD法.结果 (1)三阴性乳腺癌组织中MTDH蛋白相对表达量为2.82±1.37,而非三阴性乳腺癌组织为5.65±2.02,差异有统计学意义(t=-7.046,P<0.001).(2)在4种细胞系(MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468及MCF-10A)中,MTDH mRNA表达比较,差异有统计学意义(F=7155.320,P<0.001).两两比较结果显示:与正常乳腺细胞(MCF-10A)比较,乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468)中MTDH mRNA表达增加(P均<0.001);与MCF-7比较,MDA-MB-231、MDA-MB-468中的MTDH mRNA表达量更高(P均<0.001);MDA-MB-468中的MTDH mRNA表达低于MDA-MB-231细胞(P<0.001).4种细胞系中,MTDH蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义(F=90.053,P<0.001).两两比较结果显示:与正常乳腺细胞比较,乳腺癌细胞(MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468)中MTDH蛋白相对表达量增加(P均<0.050);与MCF-7比较,MDA-MB-231、MDA-MB-468中的MTDH蛋白相对表达量更高(P均<0.050);MDA-MB-468中的MTDH蛋白相对表达量低于MDA-MB-231细胞(P<0.050).(3)在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468中,对照组与siMTDH组的干细胞标志物sox2、Nanog及CD133相对表达量比较,差异均有统计学意义(MDA-MB-231:1.19±0.10比0.52±0.05,1.16±0.13比0.34±0.03,1.19±0.06比0.54±0.08,t=10.304、10.959、11.700,P=0.001、0.005及P<0.001;MDA-MB-468:1.26±0.05比0.34±0.02,1.19±0.07比0.52±0.04,1.21±0.02比0.37±0.01,t=31.185、15.584、75.001,P均<0.001);对照组与siMTDH组的细胞克隆数比较,差异均有统计学意义(MDA-MB-231:87.33±9.02比33.33±3.51,t=9.664,P=0.001;MDA-MB-468:70.67±4.73比24.33±3.21,t=14.041,P<0.001);对照组与siMTDH组的Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、Myc及cyclin D1蛋白表达比较,差异均有统计学意义(MDA-MB-231:0.26±0.06比0.08±0.01,0.74±0.03比0.32±0.00,0.72±0.01比0.26±0.04,t=5.115、21.222、21.690,P均<0.050;MDA-MB-468:0.33±0.03比0.15±0.06,0.56±0.04比0.22±0.02,0.65±0.02比0.31±0.02,t=4.973、13.969、21.897,P均<0.001).(4)荧光素酶报告实验结果显示:3组细胞相对荧光比值比较,差异有统计学意义(F=174.189,P<0.001),空载体组与突变型质粒转染组的相对荧光比值均高于野生型质粒转染组(P均<0.001).结论 miR-30a-5p可靶向调控MTDH,参与三阴性乳腺癌细胞干性调控,miR-30a-5p/MTDH通路可能是一个新的治疗靶点.