KCa3.1在碱性环境促进高磷诱导大鼠胸主动脉平滑肌细胞钙化中的作用

目的：探究中电导钙激活性钾离子通道（intermediate?conductance Ca2+?activated K+channels ，KCa3.1）在碱性环境促进高磷诱导大鼠胸主动脉平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells ，VSMCs）钙化中的作用及机制。方法体外培养原代大鼠主动脉平滑肌细胞和大鼠胸主动脉血管环，利用10 mmol/Lβ?甘油磷酸钠制备血管平滑肌细胞钙化、血管环钙化模型。同时使用HCl和NaHCO3调节培养基pH值，细胞、血管环被随机分为6组：正常pH7.4组、正常pH8.0组、高磷组（在高磷培养基的基础上调整pH值为7.4、7.7、8.0三个亚组）、TRAM?34（KCa3.1抑制剂）干预组（在高磷pH8.0培养基的基础上添加20 nmol/L TRAM?34）。茜素红染色法和钙含量测定法判断细胞钙化程度；von Kossa染色法和钙含量测定法判断血管环钙化程度。RT?PCR、Western印迹法检测各组细胞中调节成骨和软骨分化的关键转录因子Runx2的表达，酶联免疫吸附法测定碱性磷酸酶（ALP）活性，荧光探针法测定细胞内钙离子浓度。免疫组织化学法检测各组血管环中KCa3.1、Runx2的表达。结果体外培养VSMCs 12 d后，与正常pH7.4组相比，高磷组钙盐沉积明显增高（P＜0.05），且随着pH升高逐渐增加（P＜0.05）；与高磷pH8.0组相比，TRAM?34干预组钙盐沉积明显降低（P＜0.05)。体外培养VSMCs 4 d后，碱性环境显著促进钙离子内流（P＜0.05），增加KCa3.1、Runx2表达（P＜0.05），增加ALP活性（P＜0.05），而TRAM?34干预可显著抑制钙离子内流（P＜0.05），减少Runx2表达（P＜0.05），降低ALP活性（P＜0.05）。体外血管环培养12 d后，与正常pH7.4组相比，高磷组钙盐沉积明显增高（P＜0.05），且随着pH升高逐渐增加（P＜0.05）；与高磷pH8.0组相比，TRAM?34干预组钙盐沉积明显降低（P＜0.05）。体外血管环培养4 d后，免疫组化结果显示，碱性环境促进KCa3.1和Runx2表达（P＜0.05），TRAM?34可显著抑制Runx2表达（P＜0.05）。结论碱性环境可促进高磷诱导下大鼠胸主动脉平滑肌细胞钙化，其机制可能是通过促进平滑肌细胞钙离子内流，增加KCa3.1表达，促进平滑肌细胞表型转化来实现的。