大鼠脂肪源性干细胞PDE5基因沉默对肾小管上皮细胞缺血-复氧损伤的保护作用

目的 探讨慢病毒介导抑制脂肪源性干细胞(adipose?derived stem cells,ADSCs)磷酸二酯酶5(phosphodiesterase 5,PDE5)基因表达对缺血?复氧(ischemia/reoxygenation,I/R)损伤的大鼠肾小管上皮细胞(NRK?52E)增殖和凋亡的影响,以及ADSCs自身分泌功能和上皮转化功能的改变. 方法 分离纯化大鼠ADSCs ,传代培养及鉴定;构建PDE5?shRNA慢病毒表达载体及阴性对照(NCshRNA),采用慢病毒包装系统介导建立稳定PDE5低表达的ADSCs , Western印迹法检测PDE5蛋白表达;建立肾小管上皮细胞体外I/R模型,并建立ADSCs和NRK?52E细胞的Transwell非接触共培养体系;Edu法检测各组NRK?52E细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡;ELISA法检测各组上清中肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)水平;实时荧光定量PCR法检测E钙黏蛋白(E?cadherin)mRNA表达,流式细胞仪检测细胞角蛋白18(Cytokeratin 18 ,CK18)的表达. 结果 成功构建PDE5?shRNA慢病毒表达载体,筛选并成功建立PDE5稳定低表达的ADSCs细胞系;与正常对照组相比较,I/R组NRK?52E细胞增殖率受到显著抑制,总凋亡率明显增加(P<0.05),ADSCs共培养上清液中HGF及FGF水平升高(均P<0.05);而与阴性对照组相比,与PDE5?shRNA转染组ADSCs共培养的NRK?52E细胞增殖显著增加,凋亡率明显下降,且HGF、FGF水平进一步升高,ADSCs上皮细胞标志物E?cadherin及CK18均表达显著增加,以上差异均有统计学意义(均P<0.05). 结论 本研究应用慢病毒载体介导ADSCs稳定低表达PDE5 ,可能通过促进干细胞分泌多种生长因子,有效改善肾小管细胞I/R状态下增殖及凋亡,同时促进自身向上皮细胞分化,为干细胞体内移植治疗肾脏缺血再灌注损伤中增加肾小管上皮细胞的生存活力、提升干细胞治疗效能提供了初步的实验基础.