不同年龄脂肪来源干细胞辅助脂肪移植效果的实验研究

目的:明确年龄因素对人脂肪来源干细胞(ASCs)生物学特性的影响，比较不同年龄人ASCs辅助脂肪移植于裸鼠皮下的效果。方法:收集2018年10月至2019年12月就诊于中国医学科学院整形外科医院乳房整形美容中心，行腹部脂肪抽吸术的60例健康女性的剩余脂肪组织，年龄18～65岁。按供体年龄分为3组，每组20例，A组18～29岁，B组30～49岁，C组50～65岁。各年龄组的脂肪采用胶原酶分离获得血管基质成分(SVF)，应用Muse细胞分析仪检测各组脂肪中SVF的产量和活力；体外培养获得第2代ASCs，采用流式细胞仪检测各年龄组ASCs干细胞表面标志物表达水平；通过CCK-8法检测各年龄组ASCs的增殖能力，细胞划痕法检测各组细胞的迁移能力，体外成脂诱导分析各年龄组ASCs成脂分化潜能，通过RT-PCR检测成脂关键基因 PPAR-γ和 CEBP-α的表达水平。建立体内细胞辅助脂肪移植动物模型：应用随机数字表法将40只6周龄雌性BALB/c裸鼠随机分为4组，每组10只，包括3个实验组和1个空白对照组。实验组：分别将3个不同年龄组的1×10 6个ASCs和0.3 ml的脂肪颗粒混合后，注射于裸鼠背部脊柱两侧皮下；空白对照组：注射10 μl PBS与脂肪颗粒混合物。移植后3个月取材，比较各组脂肪移植物的重量和体积，HE染色评估脂肪细胞的完整性和坏死组织所占比例，通过围脂滴蛋白(perilipin)免疫荧光染色分析移植物内脂肪细胞的存活情况，通过CD31免疫组织化学染色评价脂肪移植后新生血管密度。使用SPSS 21.0软件进行数据分析，多组间样本比较应用one-way ANOVA， P<0.05为差异有统计学意义。 结果:Muse细胞分析仪结果显示，A、B、C 3组SVF计数分别为(7.06±1.28)×10 5/ml、(6.90±0.32)×10 5/ml、(6.40±0.62)×10 5/ml，活力分别为82.46%±2.81%、82.01%±3.85%、77.82%±3.45%，各年龄组SVF的含量未见差异，SVF细胞活力随年龄增长呈下降趋势，组间比较差异有统计学意义( F＝5.671， P＝0.008)。各组ASCs的间充质干细胞阳性表面标志物CD90、CD44、CD105、CD73表达均在95%以上，阴性表面标志物表达均在2%以下。ASCs细胞增殖能力和迁移能力随年龄增长，逐渐减缓。体外成脂分化诱导结果：油红O染色显示A、B、C 3组的吸光度值无差异，并且成脂相关基因 PPARγ和 CEBPα表达水平无明显差异。ASCs辅助脂肪移植于裸鼠皮下后3个月，A、B、C 3组移植物重量分别为(0.18±0.02) g、(0.17±0.02) g、(0.15±0.01) g，均大于空白对照组的(0.13±0.03) g，差异有统计学意义( F＝9.274， P<0.001)。A、B、C 3组移植物剩余体积分别为(262.88±17.69) mm 3、(263.83±25.96) mm 3、(240.06±25.08) mm 3，均大于空白组的(201.81±31.48) mm 3，差异有统计学意义( F＝12.95， P<0.001)。不同年龄组间移植物重量和剩余体积分别相比较，差异有统计学意义( F＝5.231、 P＝0.012， F＝3.364、 P＝0.049)。HE染色结果显示，移植后3个月，与空白对照组相比，各年龄组ASCs辅助移植脂肪可见脂肪细胞分布均匀，纤维结缔组织及坏死组织较少，各组间脂肪细胞完整性和坏死组织比例比较，差异有统计学意义( F＝3.434、 P＝0.027， F＝9.314、 P<0.001)；不同年龄组间移植物内的脂肪细胞完整性和坏死组织占比差异无统计学意义( F＝0.282、 P＝0.756， F＝0.421、 P＝0.661)；免疫荧光染色结果显示，与空白对照组相比，不同年龄ASCs辅助脂肪移植组均可观察到较多的perilipin阳性脂肪细胞，分布均匀。CD31免疫组织化学染色结果显示：A组新生血管数为(15.70±4.16)个/mm 2，B组(17.03±8.30)个/mm 2，C组(16.68±6.71)个/mm 2，空白对照组(11.50±4.04)个/mm 2，组间比较差异有统计学意义( F＝3.523、 P＝0.019)。各年龄组新生血管密度相近，差异无统计学意义( F＝0.218、 P＝0.805)。 结论:人ASCs的增殖和迁移能力随年龄的增长出现下降趋势，但年龄因素不影响ASCs的成脂分化潜能。人不同年龄ASCs均有效地提高了裸鼠移植脂肪的存活率，年轻人群ASCs辅助脂肪移植的效果优于老年人群。