微小RNA let-7c通过靶定细胞周期蛋白依赖激酶6抑制肝癌细胞增殖

目的 观察微小RNA(miRNA,miR) let-7c对肝癌细胞增殖的影响并验证其靶基因.方法 实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测人肝癌细胞MHCC-97L、HepG2、HCCLM3、SMMC-7721及人肝细胞L02中let-7c的表达.使用LipofectamineTM 2000脂质体将miRNA转染入HCCLM3细胞,设转染let-7c的细胞为let-7c组,转染阴性对照miRNA的细胞为对照组,空白组未进行转染,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测let-7c对细胞增殖的影响,流式细胞术检验各组细胞周期的差异,Western blot检测转染后细胞周期蛋白依赖激酶6(CDK6)的蛋白表达情况.将CDK6的3'端非编码区(3'-UTR)连接入pMIR-REPORT荧光素酶载体,建成荧光素酶报告基因.将miRNA、荧光素酶报告基因、海肾荧光素酶质粒共转染入293T细胞,检测转染后荧光素酶的活性,验证1et-7c对3'-UTR的结合作用.结果 肝癌细胞MHCC-97L、HepG2、HCCLM3、SMMC-7721中的let-7c表达量均低于L02,表达量分别为(3.22±0.08) ×10-4、(2.34±0.11)×10-4、(1.85 ±0.03) ×10-4、(3.03±0.11) ×10-4及(4.37 ±0.09)×10-4(P ＜0.05).let-7c组细胞在转染后48、72、96 h的吸光度值均低于对照组及空白组(P＜0.05),而对照组与空白组比较差异无统计学意义(P＞0.05).转染后72 h,let-7c组细胞处于G1期的比例为(56.95 ±2.40)％,均高于另外两组(P＜0.05),而另外两组比较差异无统计学意义(P＞0.05).转染后48 h,let-7c组CDK6蛋白的表达量均低于另外两组(P＜0.05),而另外两组比较差异无统计学意义(P＞0.05).双荧光素酶报告基因检测发现let-7c与对照miRNA比较,能抑制荧光素酶的活性(P＜0.05).结论 let-7c在肝癌细胞中的表达低于正常肝细胞,let-7c能抑制肝癌细胞的增殖,并使细胞阻滞于G1期,CDK6是其调控的靶基因.