泛素特异性修饰酶2-69对大鼠系膜细胞内饰胶蛋白聚糖表达和泛素化降解的调节

目的 研究泛素特异性修饰酶2-69(USP2-69)对系膜细胞(MC)内饰胶蛋白聚糖(DCN)表达和泛素化的调节作用.方法 ①培养MC细胞,采用Western blot法检测大鼠肾MC内USP2-69的表达;②采用免疫共沉淀、激光共聚焦和免疫荧光法,检测MC内USP2-69是否与DCN结合,并观察两者在MC内的定位;③将pRK5-USP2-69-HA质粒瞬时转染MC后,用Western blot法检测HA、USP2-69和DCN的蛋白表达,用免疫共沉淀法检测DCN的泛素化水平;④采用USP2-69siRNA处理MC,用PCR检测USP2-69和DCN的mRNA表达,用time-course Western blot法检测DCN的半衰期,Westernblot法检测DCN的下游效应分子(TGF-β1和ColⅣ)的蛋白表达.结果 ①USP2-69在MC、肝细胞(BRL-3A)和足细胞(GEC)内均有表达,其在MC内的基础蛋白表达水平显著高于BRL-3A和GEC[MCs:(0.27±0.05),BRL-3A:(0.035±0.009),GEC:(0.012 ±0.004),P＜0.01].②MC总蛋白经DCN抗体免疫沉淀后,可检测到USP2-69的表达;经USP2-69抗体免疫沉淀后,可检测到DCN表达;且在MC胞质内,代表USP2-69蛋白的荧光与代表DCN蛋白的荧光存在共定位.③转染pRK5-USP2-69-HA质粒的MC内可检测到代表外源性USP2-69表达的HA蛋白,USP2-69和DCN蛋白表达的升高,同时DCN的泛素化水平明显降低.④经USP2-69 RNA干扰的MC内DCN的mRNA水平没有明显改变,但其半衰期明显缩短(3 h),且TGF-β1和ColⅣ的蛋白表达均明显升高.结论 大鼠肾MC内USP2-69可与DCN相结合,及两者在胞质内共定位,USP2-69能够降低MC内DCN的泛素化水平及提高DCN蛋白总量并促进其功能.