脂筏在Toll样受体4促进宫颈癌低氧诱导因子-1α高活性中的作用机制

目的 探讨脂筏在Toll样受体(TLR)4促进宫颈癌低氧诱导因子(HIF)-1α高活性中的作用及机制.方法 采用体外细胞实验,对按照计算机随机法分为4组宫颈癌Siha细胞,分别采用4种方法进行处理:对于甲基-β-环糊精(MβCD)+脂多糖组进行MβCD处理及脂多糖刺激,siTLR4+脂多糖组进行siTLR4转染及脂多糖刺激,空白对照组不进行上述处理及刺激,脂多糖对照组仅进行脂多糖刺激.对4组宫颈癌Siha细胞,进行以下项目检测和观察:①采用MTT比色法测定宫颈癌Siha细胞悬液光密度(OD)值,并绘制Siha细胞生长抑制曲线,通过软琼脂集落培养实验,观察各组Siha细胞集落形成情况.②采用免疫细胞化学染色法和Western印迹法检测宫颈癌Siha细胞内HIF-1α蛋白阳性表达及含量变化.③光泽精化学发光法检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(N ADPH)氧化酶活性,DCFH-DA探针检测宫颈癌Siha细胞内活性氧含量.④采用免疫荧光染色法检测脂筏与HIF-1α蛋白的共定位关系.统计学比较上述各项检测,于4组间或处理后不同时间点(0、12、24、36、48 h)的差异.结果 ①MTT比色法和软琼脂集落培养实验结果显示,脂多糖对照组宫颈癌Siha细胞活性和集落数,均较空白对照组高或多,而MβCD+脂多糖组及siTLR4+脂多糖组,则较空白对照组或脂多糖对照组低或少,并且差异均有统计学意义(P＜0.01).②免疫细胞化学染色和Western印迹法结果显示,脂多糖对照组宫颈癌Siha细胞HIF-1α蛋白相对表达量,较空白对照组多,而MβCD+脂多糖组及siTLR4+脂多糖组,则较空白对照组或脂多糖对照组少,并且差异均有统计学意义(P＜0.05).③MβCD+脂多糖组及siTLR4+脂多糖组Siha细胞经过相应处理后12、24、36、48 h的NADPH氧化酶活性和活性氧含量,均分别较空白对照组或脂多糖对照组相应时间点低;脂多糖对照组Siha细胞经过相应处理后24、36、48 h的NADPH氧化酶活性和活性氧含量,均分别较空白对照组相应时间点高,并且上述差异均有统计学意义(P＜0.05).④免疫荧光染色结果显示,脂筏定位于细胞表面,呈绿色荧光,HIF-1α蛋白主要定位于细胞质内,呈红色荧光,并且脂筏增多的细胞,HIF-1α蛋白表达亦增强.结论 TLR4信号可能通过激活脂筏,刺激NADPH氧化酶的氧化还原信号,产生活性氧来维持宫颈癌细胞HIF-1α高活性.