miRNA-613靶向VEGFA调控乳腺癌细胞吉西他滨耐药性的机制研究

目的 探讨微小RNA613(miRNA-613)靶向血管内皮生长因子A(VEGFA)在乳腺癌吉西他滨(GCB)耐药性中的作用机制.方法 采用GCB浓度梯度递增法体外建立人乳腺癌GCB耐药细胞株MDA-MB-231/GCB.采用LipofectamineTM 2000脂质体法将miRNA-613模拟物(mimics)和空质粒转染至MDA-MB-231/GCB细胞中,分别作为转染组和空质粒转染组(NC组),将未进行任何处理的MDA-MB-231/GCB细胞作为对照组(CTL组).采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度(0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3μmol/L)的GCB条件下MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231/GCB细胞的增殖活性.采用MTT法、膜联蛋白V(Annexin V)/碘化丙啶(PI)双染法、划痕实验检测GCB对各组细胞增殖、迁移和凋亡的影响.采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测多药耐药基因1(MDR1)和B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)基因、B细胞淋巴瘤/白血病-xL(Bcl-xL)基因、Bcl-2细胞死亡调节介质(BIM)基因、存活蛋白(survivin)基因mRNA的相对表达量.采用双荧光素酶报告基因实验验证VEGFA与miRNA-613的靶向调控关系并通过实时荧光定量PCR法验证.结果 经过6个月的诱导期,成功建立体外MDA-MB-231/GCB耐药细胞株.不同浓度(0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3μmol/L)的GCB条件下MDA-MB-231/GCB细胞的增殖抑制率均明显低于MDA-MB-231细胞(P﹤0.01),GCB对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231/GCB细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为1.772μmol/L和8.791μmol/L,MDA-MB-231/GCB的耐药指数(RI)为4.96;转染组MDA-MB-231/GCB细胞miRNA-613相对表达量高于CTL组和NC组(P﹤0.05);不同浓度(0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3μmol/L)的GCB条件下转染组MDA-MB-231/GCB细胞的增殖抑制率均高于CTL组和NC组(P﹤0.05),GCB对CTL组、NC组和转染组细胞的IC50分别为8.791、8.817、3.411μmol/L;加入3.411μmol/L的GCB分别作用于CTL组、NC组和转染组MDA-MB-231/GCB细胞后,转染组细胞的迁移活性弱于CTL组和NC组(P﹤0.05),GCB对转染组MDA-MB-231/GCB细胞凋亡的促进作用强于CTL组和NC组(P﹤0.05);转染组细胞survivin mRNA、MDR1 mRNA的相对表达量均低于CTL组和NC组(P﹤0.05);miRNA-613 mimics转染前,MDA-MB-231/GCB细胞VEGFA mRNA的相对表达量高于MDA-MB-231细胞(P﹤0.05);miRNA-613 mimics转染后,转染组MDA-MB-231/GCB细胞VEGFA mRNA相对表达量低于CTL组和NC组(P﹤0.05);双荧光素酶报告基因分析结果显示,miRNA-613 mimics转染后,野生型VEGFA 3'端非翻译区(3'-UTR)序列的报告基因质粒荧光酶活性弱于转染前.结论 上调miRNA-613的表达量,可抑制VEGFA的表达,从而逆转MDA-MB-231/GCB细胞株对GCB的耐药性,可能成为乳腺癌治疗的新靶点.