PTPRO过表达对食管鳞癌TE1细胞增殖及放疗敏感性影响

目的 近年来,受体型蛋白酪氨酸酶O(protein tyrosine phosphatase receptor type O,PTPRO)被公认为是一种新的参与肿瘤发展和转移的抑癌基因.本研究通过分析PTPRO过表达对食管鳞癌细胞增殖及放射敏感性的影响,初步探讨影响放射敏感性的机制.方法 构建pCR-PTPRO-HA真核表达载体;采用脂质体转染法获得PTPRO过表达组(PTPROc1组和PTPROc2组)及空载组(Vector组)细胞株;通过实时逆转录-聚合酶链反应(real-time reverse transcrip-tion-polymerase chain reaction,RT-PCR)、蛋白质印迹法验证PTPRO表达;应用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tet-razolium,MTT)法、平板克隆形成及软琼脂克隆形成实验检测细胞体外增殖能力;使用X射线分别照射PTPROc1组、PTPROc2组和Vector组细胞株,不同细胞组再按照射剂量分为5个梯度,分别为0、1、2、4和6 Gy,照射后行平板克隆形成实验评估细胞体外放射敏感性,并采用流式细胞术分析其对细胞周期和X射线照射前后TE1细胞凋亡的影响.结果 成功构建pCR-PTPRO-HA真核表达载体;RT-PCR、蛋白质印迹法验证PTPRO mRNA及蛋白过表达成功;克隆形成实验结果表明,PTPROc1组、PTPROc2组、未转染组(TE1组)和Vector组细胞克隆形成数分别为112±6、118±4、314±7和315±4,4组间差异有统计学意义,F=42.125,P＜0.001,其中PTPROc1组细胞克隆形成数低于TE1组(P=0.008)和Vector组(P=0.009),PTPROc2组细胞克隆形成数低于TE1组(P=0.012)和Vector组(P=0.013);软琼脂克隆形成实验结果表明,PTPROc1组、PTPROc2组、TE1组和Vector组细胞克隆形成数分别为12±2、11±1、52士3和51±3,4组间差异有统计学意义,F=17.687,P=0.015,其中PTPROc1组和PTPROc2组细胞克隆形成数均低于TE1组和Vector组,均P＜0.001;流式细胞术检测结果表明,PTPROc1组、PTPROc2组和Vector组的G2/M期细胞占比分别为7.31±0.38、8.52±0.28和2.33±0.24,差异有统计学意义,F=41.223,P＜0.001,其中PTPROc1和PTPROc2组较Vector组细胞所占比例增加,差异有统计学意义,均P＜0.001;PTPROc1组、PTPROc2组和Vector组的G0/G1期细胞占比分别为77.18±0.27、77.75±0.21和73.75±0.34,差异有统计学意义,F=19.215,P＜0.001,其中PTPROc1和PTPROc2组较Vector组细胞所占比例增加,均P＜0.001;PTPROc1组、PTPROc2组和Vector组的S期分别为15.51±0.11、13.73±0.16和23.92±0.44,差异有统计学意义,F=28.221,P＜0.001,其中PTPROc1组和PTPROc2组较Vector组细胞所占比例减少,均P＜0.001;X线照射后结果显示,PTPROc1组、PTPROc2组和Vector组的ID50值分别为1.42±0.02、1.46土0.02和2.11±0.03,差异有统计学意义,F=32.255,P＜0.001,其中PTPROc1组和PT-PROc2组较Vector组降低,均P＜0.001;PTPROc1组、PTPROc2组和Vector组2 Gy射线照射后的存活分数分别为0.38±0.006、0.34±0.009和0.57±0.003,差异有统计学意义,F=25.645,P＜0.001,PTPROc1组和PTPROc2组较Vector组降低,均P＜0.001;Annexin Ⅴ-FITC/PI双染细胞凋亡实验表明,未放射处理前PTPROc1组、PTPROc2组和Vector组的凋亡率分别为(13.91±0.31)％、(14.03±0.22)％和(2.32±0.32)％,差异有统计学意义,F=28.887,P＜0.001,其中PTPROc1组和PTPROc2组较Vector组凋亡率增高,均P＜0.001;放射治疗后,PTPROc1组凋亡率为(26.33±0.82)％,PTPROc2组凋亡率为(25.43士0.95)％,均较放疗前增高,差异有统计学意义,均P＜0.001.结论 过表达PTPRO对食管癌细胞具有抑制增殖及放射增敏作用,其放射增敏机制可能与PTPRO的过表达引起细胞周期再分布和细胞早期凋亡有关.