siRNA介导RRM2沉默对卵巢癌细胞顺铂敏感性影响研究

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)介导的核糖核苷酸小亚基M2 (ribonucleotide reductase M2,RRM2)沉默对顺铂(DDP)诱导的卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP敏感性的影响.方法:采用间歇浓度梯度递增法诱导SKOV3/DDP;将RRM2基因的特异性siRNA转染SKOV3/DDP细胞,另设空白组和SKOV3/DDP-RRM2-neg(阴性组)做为对照;荧光PCR技术和蛋白质印迹法分别检测转染后备组细胞中RRM2基因mRNA和蛋白表达;MTT法检测RNAi对SK-OV3/DDP细胞药物敏感性的影响.结果:成功诱导出卵巢癌DDP耐药细胞株SKOV3/DDP细胞,其耐药系数达到3.6,属低度耐药,但对吉西他滨(Gem)仍敏感.DDP对干扰组、阴性组和空白组细胞48 h的IC50分别为(3.09±0.11)、(9.88±0.37)和(10.35±0.03) μg/mL,3者间差异有统计学意义,P＜0.001.干扰组细胞对DDP的敏感度提高了约3倍,其RF为3.3.SKOV3/DDP-RRM2-RNAi 667(Ⅰ)组RRM2 mRNA水平下调为74.1％,P=0.010;SKOV3/DDP-RRM2-RNAi480(Ⅱ)组RRM2 mRNA水平下调为55.9％,P=0.016; SKOV3/DDP-RRM2-RNAi1179(Ⅲ)组RRM2mRNA水平下调为43.1％,P=0.001.其中,以转染Ⅰ组基因沉默率(82.33％)最高,P＜0.001;阴性组(0.008 6％)与空白组(0.008 2％)比较,差异无统计学意义,P=0.133.转染RRM2的不同靶序列72h后RRM2蛋白的表达量最低,Ⅰ组为0.062±0.006,Ⅱ组为0.314±0.002,Ⅲ组为0.123±0.002,与阴性组(0.715±0.034)和空白组(0.516±0.040)比较均明显降低,但以转染Ⅰ组细胞的蛋白相对表达量下降最明显,F=658.6,P=0.003 3.Gem和DDP联合作用72 h时,转染组细胞凋亡率为(96±3.0)％,与其各组比较,差异均有统计学意义,P值均＜0.001.结论:通过RNAi技术可有效抑制RRM2基因在卵巢癌中的转录和翻译水平,增加DDP耐药细胞的药物敏感性,并促进DDP诱导的卵巢癌耐药细胞凋亡,在一定程度上逆转DDP耐药性;RNAi技术联合Gem及DDP作用可有效提高卵巢癌DDP耐药细胞的凋亡率,有望成为铂类耐药的卵巢癌晚期患者一线治疗方案.