赖氨酸去甲基化酶2A全长及截短重组质粒构建及其在细胞中的定位

目的:构建赖氨酸去甲基化酶2A(lysine demethylase 2A,KDM2A)全长及截短重组表达质粒,并初步探究其在前列腺癌CWR22Rv1细胞中的定位及机制.方法:根据KDM2A的mRNA编码序列及蛋白结构域特点设计合成KDM2A全长及截短表达序列的引物,以含有KDM2A全长编码序列的质粒作为模板,通过PCR扩增目的片段,再用限制性内切酶NotⅠ和XbaⅠ进行双酶切,连接转化后,挑取单克隆菌落扩增,并提取质粒进行酶切鉴定及测序比对.将序列比对正确的KDM2A全长及截短重组质粒转染到HEK293细胞中,进行Western Blot实验检测KDM2A全长及截短蛋白在HEK293细胞中的表达.将构建好的KDM2A全长及截短重组质粒转染到前列腺癌CWR22Rv1细胞中,进行免疫荧光染色检测外源的KDM2A全长及截短蛋白在细胞中的定位.结果:构建了KDM2 A全长及截短重组表达质粒;重组质粒能够在细胞中表达;KDM2 A全长蛋白主要分布在细胞核,少量分布在细胞质;C1截短蛋白分布在细胞核;N1、C2截短蛋白分布在细胞质.结论:KDM2A蛋白的核定位序列位于564-888位氨基酸之间,本实验为后续深入研究KDM2A在肿瘤中的作用及分子机制提供了实验基础.