用染色体缓移法分析 5′端未知序列

随着分子生物学技术的不断发展，基因克隆的方法日新月异。文库筛选获得新序列虽直接可靠，但是工作量大，周期长，耗时耗材耗力，而且选择受限于已有文库，逐渐不作为首选方法采用。 PCR技术自 1985年发明以来，以其快速敏感的特点被广泛应用于基因的表达分析及检测；近年来，其应用范围被进一步拓宽到对未知片段的克隆和分析，其假阳性率高、错配率高等缺陷亦不断得到改进；新的聚合酶的发现，使扩增产物长度可达到 20 kb（ long-distance,LD PCR） [1， 2]。同时，网络资源的共享以及网上生物学软件的免费使用，也使 PCR引物的设计和选择更趋于精确，产物特异性进一步提高。 人鼻咽是位于颅底、咽后壁之间的立方体状结构，本实验室曾用新发展的 cDNA微阵列技术克隆到鼻咽特异性表达基因 YH1[3]。为了实现转基因在鼻咽的定向表达，须获得该基因的特异性调控区。本研究利用染色体缓移的方法， PCR扩增出 YH1基因的 5′端旁侧序列，并初步分析了其调控活性。 1 材料与方法 1． 1 试剂来源 实验中所用的 Human GenomeWalker kit， Advantage-GC Genomic PCR kit， Advantage PCR Cloning kit 等均购自 Clontech公司。 1． 2 染色体缓移 实验流程：分别用 5种限制性内切酶（ DraⅠ ,EcoRⅤ ,PvuⅡ ,ScaⅠ ,SspⅠ）酶切人基因组 DNA，得到五种基因组限制性酶切片段库在基因组限切片段的末端加上接头（内含引物序列）设计两组基因特异性引物，分别与接头中的引物配对，进行巢式 PCR反应凝胶电泳检测，回收特异性 PCR产物后亚克隆测序。