定向编辑CTLA4基因的向导RNA体外合成体系的构建及其编辑效率

目的:基于CRISPR/Cas9基因编辑技术原理体外合成定向编辑细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,CTLA4)基因的向导RNA(small guide RNA,sgRNA).方法:(1)使用Crispr网站对CTLA4位点的sgRNA进行预测并设计出3个sgRNA (sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3),构建sgRNA重组质粒,将其转染293T细胞,48 h后提取基因组DNA,利用T7EN1核酸内切酶筛选活性较高的sgRNA序列;(2)以筛选到的sgRNA重组质粒为模板,设计引物并用PCR扩增体外合成sgRNA的DNA模板片段,进一步优化体外转录条件,转录出sgRNA,并利用Cas9核酸酶体外检测转录纯化sgRNA的切割效率;(3)将sgRNA与转录得到的Cas9 mRNA电转化入肺癌患者CD3+T细胞,实现靶基因敲除.结果:T7EN1核酸内切酶实验证实了sgRNA2序列靶向敲除效率最高,效率达到66％;优化体外合成体系后,转录得到的CTLA4 sgRNA2产量高,具有较高的活性,在靶点上成功切开了DNA双链,Cas9核酸酶检测出其切割效率达到了65％;最终可在肺癌患者CD3+T细胞中有效敲除CTLA4基因,CTLA4分子的表达从46％降低到22％,T7E1核酸内切酶实验进一步证实了其编辑效率为56％.结论:体外成功构建了具有较高编辑效率的定向编辑CTLA4基因的sgRNA,为后续针对该基因制定相应的免疫治疗策略奠定了基础.