重组IL-2痘苗病毒表达载体pMJ601的构建与鉴定

IL-2的全身大剂量用药虽能产生有效的抗肿瘤作用但毒性反应严重而限制了它的临床应用[1，2]。随着基因治疗技术的发展，肿瘤的基因治疗尤其是免疫基因治疗已成为引人注目的领域，被认为是肿瘤生物治疗较有潜力的策略之一。基因治疗的方法使肿瘤局部释放IL-2[1～3］可避免上述危及生命的并发症。近年来，众多研究已用ex vivo和／或in vivo法IL-2基因治疗消化道肿瘤如结肠癌[1，4]、肝细胞癌[2]和胰腺癌[3]。要使肿瘤细胞局部分泌高浓度的IL-2，需构建高效表达IL-2基因的载体系统。为此，我们构建重组hIL-2基因的痘苗病毒表达载体，pMJ601hIL-2，为进一步实施胃癌的基因治疗作必要的准备。1 材料与方法1．1 质粒及主要试剂 痘苗病毒表达载体pMJ601由Dr.Bernard Moss (NIH，USA)馈赠。克隆有hIL-2基因的质粒pBlue- scriptⅡSK+/-由陈诗书教授(上海第二医科大学人类基因治疗研究中心)馈赠。BamH I，HindⅢ限制性内切酶，美国GIBCOL公司产品。T4 DNA连接酶(T4DNA Ligase)，英国Biolabs公司产品。宿主菌DH5ct由复旦大学遗传所提供。质粒抽提试剂盒与胶回收试剂盒均购自华舜生物工程有限公司。PCRMarker购自华美生物制品公司。1．2 方法1．2．1 hIL-2与pMJ601的连接反应 克隆有hIL-2基因的质粒pBluescriptⅡSK+/-酶切后作琼脂糖凝胶电泳，从Agarose胶中回收hIL-2片段。建立20μL反应体系：无菌水5μL+T4 DNA BUF2μL+BamH I－HindⅢ双酶切pMJ6012μl+hIL-2 10μ1+T4 DNA连接酶1μl。擦入"漂"内，置14℃～16℃恒温瓶内过夜。