桔梗皂苷D通过FOXO3a通路介导前列腺癌PC-3细胞程序性坏死

目的:研究天然化合物桔梗皂苷D (platycodin D)对前列腺癌PC-3细胞程序性坏死的影响,并初步探索转录因子叉头转录因子O3a (forkhead transcription factor O3a,FOXO3a)在桔梗皂苷D诱导的PC-3细胞程序性坏死中的相关作用机制.方法:分别采用广谱的caspase抑制剂Z-VAD-FMK和特异性针对caspase-3的抑制剂AC-DEVD-CHO预处理PC-3细胞,再用不同浓度的桔梗皂苷D处理72 h,MTT法检测PC-3细胞的存活率.分别采用锥虫蓝染色及乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)释放实验检测桔梗皂苷D对PC-3细胞膜完整性(锥虫蓝染色率和LDH释放率)的影响.蛋白质印迹法检测桔梗皂苷D对PC-3细胞中程序性坏死关键因子混合谱系激酶结构区域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)、磷酸化MLKL(phospho-MLKL,p-MLKL)以及p-MLKL四聚体表达水平的影响,以及对FOXO3a及其下游分子自杀相关因子配体(factor-associated suicide ligand,FasL)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand,TRAIL)蛋白表达的影响.免疫荧光法检测FOXO3a蛋白在细胞核内的表达情况.采用脂质体转染法将FOXO3a-siRNA和阴性对照(negative control,NC)-siRNA转入PC-3细胞,蛋白质印迹法检测siRNA对FOXO3a蛋白表达水平的影响.FOXO3a基因沉默后,分别采用MTT法、锥虫蓝染色及LDH释放实验检测沉默FOXO3a基因表达后桔梗皂苷D对PC-3细胞存活率和细胞膜完整性(锥虫蓝染色率和LDH释放率)的影响.结果:随着桔梗皂苷D浓度的提高,PC-3细胞的存活率明显降低,呈浓度依赖性;同一桔梗皂苷D浓度下,Z-VAD-FMK和AC-DEVD-CHO组PC-3细胞的存活率与对照组相比,差异均无统计学意义(P值均＞0.05),提示桔梗皂苷D对PC-3细胞增殖的抑制作用是非caspase依赖性的.桔梗皂苷D处理PC-3细胞后,锥虫蓝染色率和LDH释放率均明显升高(P值均＜ 0.05).桔梗皂苷D可上调PC-3细胞中程序性坏死关键因子MLKL、p-MLKL和p-MLKL四聚体蛋白的表达水平(P值均＜0.05),并以p-MLKL四聚体的效果最显著.桔梗皂苷D促进了FOXO3a向细胞核内转位,同时上调FOXO3a及其下游分子FasL及TRAIL蛋白的表达水平.FOXO3a-siRNA转染PC-3细胞后,FOXO3a蛋白的表达水平明显下调(P＜0.05).相对于NC-siRNA+桔梗皂苷D组,FOXO3a-siRNA+桔梗皂苷D处理组细胞存活率上升(P＜0.05),锥虫蓝染色阳性率降低(P＜0.05),LDH释放率下降(P＜0.05),提示沉默FOXO3a基因表达削弱了桔梗皂苷D诱导的PC-3细胞程序性坏死.结论:桔梗皂苷D可诱导PC-3细胞呈caspase非依赖性坏死样死亡;桔梗皂苷D可能通过FOXO3a通路及促进MLKL的磷酸化介导了前列腺癌PC-3细胞程序性坏死.