利用CRISPR/Cas9技术构建CYP2E1基因敲除的HEK293FT细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9系统在HEK293FT细胞系中敲除基因并探讨其在检测化学物毒性中的应用.方法:设计CYP2E13对分别靶向CYP2E1基因第2、第3和第7外显子的sgRNA序列并构建PX461表达载体;将携带靶向CYP2E1的sgRNA表达载体转染至HEK293FT细胞中,通过SURVEYOR检测分析sgRNA的切割效率;利用有限稀释法获得CYP2E1敲除细胞株,通过实时荧光定量PCR和蛋白印迹检测细胞株中CYP2E1的敲除效果;并检测其对N-(4-羟基苯基)乙酰胺和1,2-二氯乙烷的细胞毒性效应的影响.结果:SURVEYOR检测分析靶向CYP2E1基因第3外显子的sgRNA的切割效率为23％;成功构建了2株CYP2E1基因敲除的细胞株,实时荧光定量PCR结果显示CYP2E1 mRNA表达下降,蛋白印迹结果显示CYP2E1蛋白无表达;CYP2E1基因敲除会显著降低N-(4-羟基苯基)乙酰胺和1,2-二氯乙烷的细胞毒性.结论:通过CRISPR/Cas9构建出CYP2E1稳定敲除的肾细胞系,为研究CYP2E1的功能和作用机制提供了有效的工具.