叶黄素对H2O2诱导的人视网膜Müller细胞氧化应激干预的作用机制

背景 氧化应激是年龄相关性黄斑变性(AMD)的主要因素之一.研究表明叶黄素对AMD有预防作用,但是其抗氧化机制仍不明确.Müller细胞是视网膜氧化应激反应的靶细胞之一,研究叶黄素对Müller细胞的氧化应激是否具有保护作用及其作用机制对于视网膜疾病的治疗具有重要意义. 目的 研究叶黄素对视网膜Müller细胞核因子E2相关转录因子2/抗氧化反应原件(Nrf2/ARE)信号途径的影响. 方法 人Müller细胞株进行常规培养,将对数生长期的细胞接种于96孔培养板,在培养液中分别加入不同浓度(40、80、160、320、640 μmol/L) H2 O2,绘制Müller细胞的凋亡曲线,取H2O2的半数致死量,即160 μmol/L制备Müller细胞氧化应激模型.将模型细胞分为模型对照组和不同质量浓度(12.5、25.0、50.0 mg/L)叶黄素组,根据分组情况分别在培养液中加入相应质量浓度的叶黄素,用常规培养的细胞作为空白对照组.采用MTT比色法测定各组中Müller细胞增生值(吸光度,A值)和凋亡率;采用流式细胞仪检测各组细胞中活性氧簇(ROS)的荧光强度;采用实时荧光定量PCR检测细胞中Nrf2 mRNA和血红素加氧酶-l(HO-1) mRNA的相对表达量;采用Western blot法检测各组细胞中Nrf2和HO-1蛋白的表达水平(灰度值). 结果 MTT比色法检测显示,随着H2O2浓度的增加,细胞增生抑制率逐渐增加,各组间总体比较差异有统计学意义(F=43.890,P＜0.01).空白对照组、模型对照组及12.5、25.0、50.0 mg/L叶黄素组细胞凋亡率的总体比较差异有统计学意义(F=346.770,P=0.000),其中随着叶黄素质量浓度的增加,细胞凋亡率逐渐下降,组间比较差异均有统计学意义(均P＜0.05).空白对照组、模型对照组及12.5、25.0、50.0 mg/L叶黄素组细胞中ROS含量分别为1.92±0.18、64.89±2.86、52.70±2.80、32.61±4.20和5.68±1.35,随着叶黄素质量浓度的增加,ROS含量逐渐下降,组间总体比较差异有统计学意义(F=324.900,P=0.000).各质量浓度叶黄素组细胞中Nrf2和HO-1mRNA相对表达量及细胞中HO-1和细胞核中Nrf2蛋白表达量均明显高于模型对照组,各组间总体比较差异均有统计学意义(F=236.960、242.620、186.830、263.120,均P=0.000),随着叶黄素质量浓度的增加,Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA及其蛋白的表达量逐渐增加,组间比较差异均有统计学意义(均P＜0.05),但各组间Müller细胞的细胞质中Nrf2蛋白表达量总体比较差异无统计学意义(F=1.790,P=0.210).结论 叶黄素通过上调Nrf2的表达和核转位诱导抗氧化酶的表达,从而抑制Müller细胞的氧化应激反应.