高糖环境对视网膜血管内皮细胞自噬的影响及机制

目的 研究高糖培养环境对恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞(RF/6A)自噬的影响及机制.方法 将体外培养的RF/6A细胞随机分为对照组、高糖组和3-甲基腺嘌呤(3-MA)+高糖组,对照组细胞在无糖培养基中培养,高糖组细胞在培养基中加入25mM D-glucose进行培养,3-MA+高糖组用5 mg/ml 3-MA预处理1.5 h,然后置于含25 mM D-glucose的培养基中继续培养.培养48 h后,采用Western blot法检测各组细胞的自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)、Atg5及关键信号通路蛋白PI3K、AKT、mTOR的表达,采用可表达mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒感染细胞,激光共聚焦显微镜下观察细胞内自噬的变化.结果 ①对照组、高糖组、3-MA+高糖组细胞中的LC3B-II/LC3B-I值、Atg5值分别为(0.19±0.02、0.58±0.06和0.43±0.04)和(0.35±0.05、0.96±0.06和0.83±0.06),组间总体比较差异均有统计学意义(LC3B-II/LC3B-I:F=55.58,P=0.000;Atg5:F=100.35,P=0.000).高糖组细胞中LC3B-II/LC3B-I值和Atg5值均明显高于对照组和3-MA+高糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05),3-MA+高糖组的LC3B-II/LC3B-I值和Atg5值均高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05).②对照组、高糖组、3-MA+高糖组细胞中的PI3K值、AKT值和mTOR值分别为(0.93±0.06、0.94±0.07和0.89±0.07)、(0.95±0.05、0.94±0.04和0.90±0.02)和(0.81±0.04、0.82±0.04和0.80±0.02),组间总体比较差异均无统计学意义(均P>0.05);三组磷酸化蛋白p-PI3K值、p-AKT值和p-mTOR值分别为(0.74±0.02、0.40±0.02和0.70±0.02)、(0.87±0.02、0.47±0.02和0.77±0.06)和(0.76±0.03、0.38±0.02和0.70±0.02),组间总体比较差异均有统计学意义(p-PI3K:F=249.92,P=0.000;p-AKT:F=100.94,P=0.000;p-mTOR:F=218.21,P=0.000).高糖组细胞中p-PI3K、p-AKT和p-mTOR值均明显低于对照组和3-MA+高糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05),3-MA+高糖组的p-PI3K、p-AKT和p-mTOR值均低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05).③对照组细胞浆中出现较弱的GFP(绿点)和mCherry(红点)荧光信号,高糖组黄点(红绿荧光融合)和红点明显多于对照组,自噬增强;3-MA+高糖组黄点和红点较高糖组减少,自噬减弱.结论 高糖环境通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路激活RF/6A细胞自噬.